肿瘤疫苗的作用机制

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1肿瘤特异性免疫机制及肿瘤的免疫逃逸机制肿瘤在机体内能引发体液免疫应答和细胞免疫应答，而以后者为主.肿瘤抗原在细胞内加工成肽段后与细胞表面的主要组织相容性复合体Ⅰ(majorhistocompatibilitycomplex,MHCⅠ)类分子结合并呈递给CD8+细胞毒性T淋巴细胞，或先从肿瘤细胞上脱落，再由抗原提呈细胞摄取、加工成肽段后与表面MHCⅡ类分子结合并呈递给CD4+辅助性T淋巴细胞，进而诱发机体的抗肿瘤细胞免疫应答.值得注意的是CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的激活都需要MHC抗原肽复合物和免疫共刺激分子的协同刺激作用［1］，而共刺激分子的缺失正是肿瘤引发的机体外周免疫耐受的可能机制之一.肿瘤由于其极大的异质性和遗传不稳定性，在机体环境长时间的免疫选择压力下，会启动一系列的免疫逃避机制，对抗机体的抗肿瘤免疫反应.这些机制分别针对T细胞对肿瘤的识别阶段和效应阶段，包括肿瘤抗原的丢失、MHCⅠ类分子表达下调、抗原加工缺陷、表达干扰细胞毒作用的蛋白酶及表达FasL等［2］.

2肿瘤疫苗的设计策略

2.1总体思路针对肿瘤抗原在机体内免疫原性下降，造成特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受的状况，肿瘤疫苗设计策略的总体思路是应用各种技术，增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力，改善免疫微环境，引发有力的特异性抗肿瘤细胞免疫，阻止肿瘤进展，最终消除肿瘤.

2.2肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗是将整个肿瘤细胞作为抗原导入患者体内，诱导特异性的抗肿瘤免疫应答.由于肿瘤细胞带有肿瘤的全部抗原，无需考虑分离肿瘤特异性抗原（tumorspecificantigen,TSA），而且由于自体肿瘤细胞具有和正常组织相同的人类白细胞抗原，不会引发机体的免疫排斥反应，因此被认为是理想的肿瘤疫苗方案.但是自体肿瘤组织来源十分有限，并且考虑到TSA的表达具有一定的组织特异性，因此这种方法的应用受到了限制［3］.后来，人们开始使用人工培养的同种异体肿瘤细胞系进行肿瘤疫苗的研究.不同肿瘤细胞的混合能够提供一系列的TSA，有利于增加肿瘤疫苗的免疫原性，减小其发生抗原丢失的几率［2］.但是，单独使用自体或异体的肿瘤细胞难以产生足够强度的免疫应答，免疫佐剂的使用极大地改善了这种情况.随着基因工程的进展，人们开始对肿瘤细胞进行基因修饰，将编码免疫共刺激分子如CD80，CD86的基因，导入肿瘤细胞中，为T细胞活化提供第二信号，有效地打破了肿瘤的外周免疫耐受.近年来，也有人将编码一些细胞因子如IL2，IL12，粒巨噬细胞集落刺激因子（granulocytcmacrohagecolonystimulatihyfactor,GMCSF）等的基因导入肿瘤细胞，期望通过细胞因子蛋白的表达，改善肿瘤组织局部免疫微环境，增强T细胞的抗肿瘤免疫效应［4］.然而，近些年来临床实验表明，即使在实验中能够诱发满意免疫反应的肿瘤细胞疫苗，在转化成临床有效的治疗性肿瘤疫苗时都遇到了困难.Fifis等［5］的研究发现，大鼠结肠癌细胞系经体外培养后免疫同源小鼠，引发了免疫反应和肿瘤保护效应.然而，当他们对荷瘤小鼠进行同样处理时，却大大促进了肿瘤的生长，提示肿瘤细胞能够通过一系列机制抑制机体的抗肿瘤免疫反应，包括分泌免疫抑制因子IL10，肿瘤生长因子β阻止有效的免疫反应；分泌血管内皮细胞生长因子，GMCSF等因子活化具有免疫抑制作用的骨髓源性细胞；激活特异的调节性CD4+CD25+T细胞以下调细胞毒性T淋巴细胞的效应等.

2.3肿瘤抗原疫苗肿瘤能够引起机体特异性免疫反应的现象引发了对肿瘤抗原的研究.肿瘤抗原包括多个层次：完整的蛋白质分子、抗原肽及纯化的DNA.关于肿瘤DNA疫苗，下文将另行讨论.目前将肿瘤抗原分为TSA和肿瘤相关抗原（tumorassociated,TAA）.TSA是指只存在于肿瘤细胞，而TAA并非肿瘤细胞特有的抗原，只是在发生肿瘤时此类抗原的表达明显上调.Tabi等［2］认为，肿瘤抗原必须在全部或大多数患有相同肿瘤患者的大部分肿瘤细胞中呈普遍的高表达状态.他将肿瘤抗原分为5类：①突变抗原；②肿瘤细胞过度表达抗原；③癌睾抗原;④组织特异性分化抗原；⑤病毒抗原.

单独应用肿瘤抗原蛋白存在免疫原性差的问题，这是由于肿瘤细胞可通过抗原、HLA缺失等机制发生逃逸.刘宏利等［6］结合了肽疫苗和DNA疫苗各自的特点，以P815肿瘤细胞的CTL表位（P815A3543）为模型，合成该表位加多聚赖氨酸的颗粒性多肽，并制备含有编码此表位和GMCSF基因的表达质粒，制成了新型的颗粒性肽DNA复合疫苗，这种疫苗利于APC的摄取加工，可诱导有效的CTL应答，从而预防小鼠致命性P815肿瘤细胞攻击，并可部分根除肿瘤.

超抗原能够激活全部携带T细胞抗原识别受体Vβ片段的T细胞,激活的T细胞克隆数约是普通抗原的1000倍,产生强大的杀伤靶细胞的作用.马文学等［7］用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET28aTMSEA转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌,并诱导其表达跨膜型超抗原融合蛋白，实验结果显示，跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上，显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，并延长其生存期,为肿瘤抗原疫苗的研究提供了新思路.

热休克蛋白（heatshockprotein,HSPs）作为细胞内的分子伴侣，通过其多肽结合结构域与一系列肿瘤相关抗原形成复合物，同时HSPs通过HSP受体CD91和LOX1介导被APC摄取［8-9］，于是，将肿瘤抗原与HSPs在基因或蛋白水平进行连接，可使机体提高特异性和非特异性抗肿瘤免疫的水平.自体肿瘤HSPgp96抗原肽疫苗已进入临床Ⅲ期，但是由于这种疫苗具有很强的个体特异性，因此只对同源肿瘤起作用，而且由于自体肿瘤HSP抗原肽复合物需要从肿瘤患者体内提取，来源受到了很大限制.目前研究方向是体外合成HSP抗原肽疫苗，如将HSP与肽或全蛋白进行连接；将HSP的DNA与抗原DNA连接后表达融合蛋白［10］；或将HSP基因直接注入肿瘤细胞提高其免疫原性［11］.

独特型(idiotype，Id)单抗原显著优点在于它能引发针对相应自身抗原的体液免疫应答，抗Id的抗体(Ab2)能够模拟TAA，并作为TAA的内影像诱发抗肿瘤免疫.Chang等［12］研究了小鼠抗独特型mAbMK223模拟人类高分子量黑色素瘤相关抗原（HMWMAA）的结构基础，发现MK223重链的互补决定区（CDR）3（H3）、轻链的CDR1（L1）在三维结构上紧密相连，该区域的部分氨基酸序列与HMWMAA核心蛋白的相似折叠区具有同源性，同时发现组成MK223H3环的15氨基酸残肽在体内和体外均可与HMWMAA引发相似的免疫反应.抗Id抗体已进入临床研究阶段，在淋巴瘤、结肠癌、乳腺癌、黑色素瘤的治疗中表现出了较好效果.CD55是表达在结直肠癌细胞表面的糖蛋白，可保护肿瘤细胞免受补体的攻击，Ullenhag等［13］用模拟CD55的人类抗IdmAb105AD7对67例结直肠癌患者进行了免疫，大多数患者在酶联免疫斑点试验和免疫细胞增殖反应中表现出了抗肿瘤免疫反应.

2.4肿瘤DNA疫苗肿瘤DNA疫苗的原理就是将编码肿瘤特异性抗原的裸DNA分子直接注入机体或者经载体携带后注入机体，肿瘤DNA被体内肿瘤细胞或正常细胞识别并摄入，在细胞内表达肿瘤特异性抗原，引发机体持久的细胞和体液免疫.肿瘤DNA疫苗由质粒DNA骨架、抗原DNA和真核细胞基因调控序列组成.

肿瘤特异性DNA分子在体内被肌肉、皮肤、黏膜等易感处的细胞摄取后，表达出抗原蛋白，经加工处理后与MHCⅠ分子结合呈递于细胞表面，激活CD8+T细胞，刺激CTL的形成和分化，产生细胞免疫作用；还有一部分抗原蛋白分泌至细胞外，被抗原提呈细胞吞噬加工后与MHCⅡ分子共同表达于细胞表面，呈递给CD4+T细胞，激活体液免疫应答［14-15］.DNA疫苗不仅激活了肿瘤特异性体液免疫应答，产生了大量抗体，还激活了被认为是人体抗肿瘤免疫关键细胞的CD8+T细胞［16］，这无疑是肿瘤DNA疫苗的一大优势.而且由于DNA疫苗分子进入人体后才开始其抗原蛋白的合成表达，因此DNA疫苗能够模拟病毒感染的自然过程，合成蛋白被降解加工，作为内源性分子由MHCⅠ分子提呈给CD8+T细胞，激活强有力的细胞免疫应答，较之肿瘤抗原肽进入人体经APC加工提呈给CD4+T细胞，再激活体液免疫要有效得多.同时，携带肿瘤抗原基因的质粒DNA可长期在宿主细胞内控制表达肿瘤抗原蛋白，因此具有长期持续的效果，有望使机体获得持久的抗肿瘤免疫功能.

Niethammer等［17］用携带编码癌胚抗原（carcinoembryonicantigen,CEA）基因的沙门氏菌感染小鼠，联合抗体IL2融合蛋白，观察到MHCⅠ的表达，大量CD8+T细胞被激活，100%的小鼠皮下肿瘤完全消除，75%的小鼠肺转移得到抑制.CD2，CD25，CD28以及CD48，CD80水平的明显上调表明CTL和负责抗原提呈的DCs在接受DNA疫苗的免疫刺激后得到了有效的激活.然而在临床研究中，DNA肿瘤疫苗没有达到令人满意的效果.Conry等［18］用表达CEA和HBV表面抗原的质粒DNA免疫17例结肠癌转移患者，未见明显的临床变化，患者产生针对CEA的淋巴细胞增殖但未检测到CEA特异性抗体.然后,人们对DNA疫苗做了一系列改进，主要从递送系统和免疫佐剂两方面加强质粒DNA的免疫原性.基因枪运载质粒DNA的效率远远高于普通注射器和生物注射器，在Trimble等［19］对此进行的比较中，基因枪运载质粒DNA的方法诱导出了最多的CD8+T细胞和最佳的抗肿瘤免疫反应.由于这种途径能直接转染组织局部的Langerhans细胞［20］，因此诱导免疫所需要的质粒DNA用量可大大减少，同时，免疫佐剂也被用于质粒DNA.研究证明，将编码细胞因子、细菌毒素、蛋白佐剂的DNA与携带抗原基因的质粒DNA有机融合后，能加强质粒DNA的免疫原性［21］.然而，Lima等［22］的研究发现,用CEA和GMCSF融合DNA疫苗免疫小鼠后，高剂量组CEA引发的特异性体液和细胞免疫得到大大激活，但同时也产生了大量抗GMCSF的自身抗体，而用单独的CEADNA疫苗免疫小鼠，肿瘤生长被完全抑制.这提示肿瘤抗原基因和细胞因子基因的融合疫苗在增强疫苗免疫效能的同时打破了机体对于细胞因子的免疫耐受,从而降低细胞因子的免疫佐剂功能,甚至可能对致敏宿主造成长期的损害［22］.

除了质粒DNA外,病毒载体的DNA疫苗也进入了临床研究阶段.病毒载体的DNA疫苗有更强的激活固有免疫反应的能力，通过TLR依赖和非依赖途径募集和活化抗原特异性T细胞，同时病毒载体激活的炎症信号能够影响IFN1依赖的CD8+T细胞的局部扩增和免疫记忆的形成.最常用的病毒载体是重组腺病毒和重组痘病毒载体［23］，重组腺相关病毒、α病毒、口腔泡状病毒、单纯疱疹病毒还处于早期研究阶段.ATP依赖的抗原呈递相关转运蛋白（TAP1）在抗原直接提呈给CD8+T细胞和外源性抗原在树突状细胞（DCs）中交叉提呈的过程中发挥着重要作用.由于TAP1在肿瘤细胞中表达极度低下，肿瘤细胞表面抗原的表达缺失造成其极易发生免疫逃逸.Lou等［24］给恶性黑色素瘤小鼠注射编码人TAP1的重组不复制腺病毒，诱导出了有效的抗肿瘤CTL反应，肿瘤浸润性的DCs细胞增加，记忆性T细胞亚类增多，动物存活期延长.而在此病的研究中，携带表达MAGE1和MAGE3迷你基因的重组ALVAC在30例黑色素瘤患者中仅有1例出现免疫反应，2例病情稳定［25］.这可能与患者血清中存在的抗病毒载体的抗体有关.

2.5树突状细胞（dendriticcell,DCs）肿瘤疫苗DCs是体内最强大的专职抗原提呈细胞，它能够识别、捕获、加工、提呈抗原引发初始免疫反应.将TAA直接导入DCs，使其发挥提呈抗原并激活T细胞的功能，成为肿瘤免疫治疗的有效途径.方法有用肿瘤细胞裂解产物、肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原多肽、合成肿瘤抗原肽冲击DCs细胞，或用肿瘤来源的RNA冲击DCs，也可以将肿瘤细胞与DCs细胞进行融合，或用肿瘤抗原病毒载体转染DCs.

近年来，热休克蛋白抗原肽复合物激活DCs诱导抗肿瘤免疫受到了广泛关注.HSP70－抗原肽复合物负载的DCs比单独用抗原肽或HSP负载的DCs能更有效地激活T细胞、抑制肿瘤生长，而且HSP辅助提呈肿瘤抗原时使用更小量的抗原肽［26］.Moran等［27］将委内瑞拉马脑炎病毒复制子转染DCs细胞，用其免疫过表达neu原癌基因蛋白的荷瘤小鼠，结果转基因高水平表达，DCs细胞成熟并分泌前炎症因子，诱导活化NEU特异性CD8+T细胞，产生抗NEU的IgG抗体.有趣的是，耗竭小鼠CD4+T细胞而非CD8+T后，T细胞完全失去了抑制肿瘤生长的能力，提示CD4+T细胞在肿瘤生长抑制中发挥了重要作用.肿瘤组织来源的RNA转染DCs被证明具有强大的抗原性、更多的作用靶点和更高的安全性，经过一系列动物实验，目前已进入临床研究.Su等［28］将PSAmRNA转染DCs，免疫治疗转移性前列腺癌，检测了患者外周血PSA水平和癌细胞数量，证明疫苗可引起有效的抗原特异性免疫反应，未见明显毒副作用.

3问题与展望随着对肿瘤免疫机制研究的深入，肿瘤疫苗成为临床预防和治疗肿瘤有效方法的趋势日益明显.尽管肿瘤疫苗的有效性在动物实验中取得了振奋人心的效果，但其在临床研究中的治疗结果尚未令人满意.如何寻找和筛选有效的肿瘤抗原，激活机体的细胞和体液免疫应答；如何打破机体对肿瘤的外周耐受从而更有效的行使其免疫监视功能；如何改善免疫微环境，减少肿瘤对机体免疫反应的抑制；以及后续肿瘤疫苗进入机体的有效途径，免疫方法等均需要进一步的研究.使用佐剂、细胞因子及其它有效的方法，如利用DCs强大的抗原提呈能力，大大增加了肿瘤疫苗的免疫原性；抗肿瘤T细胞的活化需要双信号，共刺激分子B7通过激活T细胞表面的CD28分子活化免疫反应，通过激活细胞溶解性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）分子则抑制免疫反应，有人已设想通过阻断T细胞表面的CTLA4以利于肿瘤杀伤性T细胞克隆的激活；近年来CD4+CD25+自身调节T细胞（Treg）在肿瘤免疫中的抑制作用受到了关注，如何拮抗Treg细胞对抗肿瘤免疫的抑制，优化局部免疫微环境，从而活化免疫细胞识别、排斥肿瘤的作用也是研究的方向.有研究证明，不同的疫苗接种途径及程序会对肿瘤疫苗的治疗效果产生有意义的影响，据此寻找最佳的免疫程序，发挥肿瘤疫苗的优势也值得研究.此外，实验和临床研究发现，肿瘤疫苗对早期肿瘤、手术切除肿瘤或经放化疗已明显缩小的肿瘤具有更好的治疗效果，提示将肿瘤疫苗与手术、化疗、放疗及移植等手段结合起来应用，以达到满意的治疗效果.

随着基础研究和临床试验进一步的开展，我们对肿瘤疫苗的认识也将更加深入，有理由相信，新的安全、有效、抗原性更强、适应范围更广的肿瘤疫苗终将为广大肿瘤患者带来福音.

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