吴茱萸研究论文

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子宫肌瘤是妇科最常见的良性肿瘤,由平滑肌纤维和结缔组织组成,所以临床上又称子宫纤维瘤。子宫肌瘤好发于20～50岁的妇女,其中年龄＞40岁的妇女约有50%患有子宫肌瘤,但Cramer和Patel经尸体解剖(autopsy)的统计后认为子宫肌瘤的发生率高达75%［1］。

对于一个不需再生育的妇女而言,全子宫切除(totalhystectomy)是治疗子宫肌瘤的方法之一,然而台湾地区子宫切除术是否有过于泛滥的情形常受质疑。有研究指出台湾地区子宫切除率以台北、台中、高雄为高。变异大多可由医疗资源分布解释,而子宫切除年龄最高分布在40～44岁占29.9%。除癌细胞病变外,以生殖器脱垂的病变为最高,这可以由医疗不适当性解释［2］。因而子宫切除的适当性除须由专家审视外,如果能有更多其他替代疗法,也是对妇女的一种保障。

子宫肌瘤真正形成的原因,至今尚不清楚,但有不少研究认为雌激素(estrogen)与黄体素(progesterone)与子宫肌瘤的生长有密切关系,这些激素又必须透过生长因子(growthfactor)才能运作［3］，而人绒毛膜促性腺激素(human，HCG)也能调节生长。黄体素可刺激子宫肌瘤上皮生长因子(epidermalgrowhfactor)产生，造成子宫肌瘤的增生和分化。子宫肌瘤虽然是由单一的细胞突变开始,而雌激素可增加雌激素接受体(estrogenreceptor,ER)与黄体素受体(progsteronereceptor,PR)也可促进子宫肌瘤的增生。黄体素则对突变的正常子宫细胞有加速分裂和增生的作用［4］。

性腺激素释放激素强化物(GnRHa)是经由降低GnRH接受体而使性腺分泌减少,进而使卵巢分泌雌激素和黄体素减少,而抑制子宫肌瘤生长［5］。根据国内研究,GnRHa在连续注射到12周时,达到最大的疗效,大部分的子宫肌瘤会缩小为原来的一半。缩小的百分比和未结合PR浓度成反比,而和未结合ER关系不大。因此GnRHa可缩小子宫肌瘤,部分取决于子宫肌瘤上未结合性激素接受体浓度所影响［6］。

子宫肌瘤属于中医医学“积聚”“瘕”范围,瘕是泛指腹腔内的有形肿块而言,所谓者,是指腹腔内有形的肿块,有一定的部位,属血病。所谓瘕者,是指腹腔内无形的气块,无一定的部位,属气病。《内经・灵枢・水胀篇》谓;“石瘕生于胞中,寒气客于子门,子门闭塞,气不得通,恶血当泻不泻,以留止,日益以大,状如怀子,月事不以时下,皆生于女子,可导而下”。《校注妇人良方》谓“妇人腹中瘀者,由月经闭积,或产后血未尽,或风寒滞瘀,久而不消,则为积聚瘕矣”。因此中医认为,六淫之邪,七情内伤,引起脏腑功能失调,气血不合,以致气滞血瘀,新血与旧血凝聚成块,结于胞室,日益长大而成子宫肌瘤。

子宫肌瘤临床表现为月经过多,经期延长,周期缩短,或不规则子宫出血,常会伴有不同程度的贫血。中医认为,脏腑不合,气滞血瘀,冲任失调是本病的主要原因,临床上可以辨证分型治疗。本病是以子宫出血为主要临床症状,病久失血,而导致气血两虚,在治疗时,除出血期以化瘀止血、平时破瘀消外,还必须结合补益气血。对于瘕的治法,《内经》提出“坚者削之,结者散之,留者攻之,滞者导之”的原则;《女科经纶》：“善治瘕者,调其气而破其血,消其食而豁其痰,衰其大半而止”。

汉方医学已有数千年之历史,而且是累积经验的循证疗法之一,由于化学药物引起的药害,以及食品添加物或清洁剂引起的公害等,引起人们对利用自然药物的兴趣,纷纷把目光转向天然中药。依据汉方的思想,绝大多数的妇女疾病是属于体内“血”的异常,中医所谓的“血”,不单是指血液,也包括淋巴液或激素作用。中医对女性的生理及病理独具慧眼,其用药经验可以说是数千年来累积而成。

中药的运用是几千年来前人智慧结晶所在,其内容相当丰富且千变万化。从《内经》、《伤寒论》始,前人从药物的升降浮沉,四气五味,虚实补泻,脏腑归经,针对人体阴阳表里,寒热虚实,把数百种药物归纳,依据理论用于临床。

本研究已建立细胞模式,以期能从天然产物中找出明确具有治疗子宫肌瘤之中药,为医师临床用药提供参考,造福更多的妇女。

1实验材料

1.1中药材来源本项研究所测试的中药材来自台北南京泰生堂参药有限公司,实验中药材见表1。

表1单味药材50%酒精之萃取率略

1.2仪器(1)回转式真空减压浓缩机(SwitzerlandBUCHIRE111);(2)离心机Centrifuge5415C(Eppendorf);(3)冷冻干燥机(Eyela;CoolAce.CA-105);(4)微量电子天秤(Shimazu,LibrorACF-200)；(5)显微镜(Olympus,Tokyo)；(6)二氧化碳培养箱(EspecBNA-211)；(7)血细胞计数器(Hemocytometer;Bright-line)；(8)组织培养角瓶(Corning)；(9)组织培养皿(Falcon)；(10)96-Well组织培养盘(Corning)；(11)微量吸管(Biohit)；(12)高温灭菌器(Tomin1MedicalEquipmeneCo,LTD;TM-325)；(13)过滤膜(Coming)；(14)-80℃冰箱(EnviromentalEquip.Co;So-Low)。

1.3子宫肌瘤细胞由荣民医院妇产科提供病理检体。当患者在妇产科门诊,以内诊与超声波扫描确诊为子宫肌瘤,依临床路径安排入院手术治病者,以做本研究之素材。即由此类患者在手术切除后,立即切取肌瘤组织,放入转输液(DMEM)中,送实验室做组织培养。

1.4试药与试剂

1.4.1培养液（1）DMEM(Dulbecco’sMinimumEssentialMedium)；（2）FetalBovineSerum(Hyclone:CatNo.1115-L)；（3）Penicillin-Strepetomycin(Seromed:CatNo.03-033-1B)；（4）L-Glutamine(Seromed:CatNo.0020-1B)；（5）NAA(Mem-EagleNon-essentialAminoAcidsSolution)；（6）L-Glutamine200mM(Gibco:CatNo.25930-081)。

1.4.2染色剂（1）Trypanblue(Sigma)；（2）MTT:{3(4,5-dimethylthiazoled1-2-y1)-2,5-dipheyltetrasoliumbromide}(BoehringerMannheimGmbKCatNo.1465007)。

1.4.3一般化学药品（1）DMSO(Merck,Germany,K23951931,Max0.05%H2O)；（2）SodiumHydrogenCarbonate(Merck,Germany,NaHCO3;Proanalysis)；（3）Isopropanol(Merck,Germany)。

1.4.4测试药品与酵素（1）B-Estradiol(SigmaUSA)E-2758Lot79H0941；（2）Progesteronl(SigmaUSA)P-8783Lot80K0885；（3）Trypsin,2.5%(SigmaUSA)Lot1077108；（4）Trypsin-EDTA(SigmaUSA)Lot1089908；（5）LSAB(Dako,Denmark,CodeNo.K0675)；（6）MonoclonalAnti-HumanProgesteronereceptors(Dako,Denmark,clonepgR636,1:50)。

2实验方法

2.1单味药之制备将单味药经粉碎后,加十倍重量之50%酒精,60℃水浴回流抽取2h,趁热过滤。同法两次后合并滤液经减压浓缩制约1/10体积量。经冷冻干燥得粉末状浓缩物,其产率见表1所示,将冷冻粉末置于20℃冰柜中以备下列实验使用。

2.2一般溶液之配制

2.2.1PBS(phosphatebuffersolution)之配制将KCl0.2g，NaCl3.0g，NaH2PO4・7H2O2.16及KH2PO40.2g溶于次蒸馏500ml中,高压减菌后使用。

2.2.2MTT配制方法称取MTT5mg溶于10ml成浓度500μm,制完全溶解后以0.22μm之过滤膜过滤。

2.3检测药物之制备实验前将冷冻干燥之各种药品精称10mg,以1mlDMSO溶解,再用研钵细磨后,以0.22μmmicrofilterunit过滤,分别调制成浓度为10mg/ml之stocksolution。每次检测时,加入2μlstocksolution于每孔含198μl培养液中,使最后单位药之浓度100μg/ml。

2.4试验细胞之制备

2.4.1子宫肌瘤和正常子宫组织从荣民医院手术室取出后,置于含DMEM的试管中,以冰块冷冻带回实验室,于1h内切碎进行组织培养。

2.4.2子宫肌瘤和正常子宫组织将其分别切成1mm之小块,加入1.5mg/mlcollagenasetypeⅡ和0.25%trypsin各3ml,于37℃。4h后呈黏稠状,用胶吸管打散细胞(pipetting),经离心(1200r,4℃,5min)去上清液。加入DMEM,再离心后去上清液。加入5mlDMEM均匀分布于培养皿,2天换一次培养液,于5%CO237℃培养7～14天。待细胞生长形成单层细胞(monolayer)细胞数约1×106cells/ml既可使用。

2.5试验细胞之染色将初代培养的子宫肌瘤细胞和正常细胞,培养于培养皿中,利用免疫组织化学方法,经染色、照相后,作为试验细胞鉴别区分之用。组织培养之新鲜标本于培养基中,以PBS溶液清洗,再以0.03%过氧化氢溶液浸泡30min,经PBS溶液清洗10min,接着进行免疫化学染色,所使用的单株抗体为抗人类黄体素接受抗体(monoclonalanti-humanprogesteronereceptorsantibody)。以适当浓度之单株抗体与培养细胞作用约1h,经PBS溶液洗10min后,以经生物素标示之二次抗体(biotinylatedsecondaryantibodies)作用30min,在经PBS溶液清洗10min后,以经具有过氧化酶之卵蛋白作用30min,经PBS溶液清洗10min后,以呈色剂(DAB,3,3-diaminobenzidine)呈色5min,以PBS溶液清洗,以苏木精做对比染色,之后置于镜下观察照相［7～9］

2.6Bcl-2蛋白之制备利用0.25%trypsin将细胞处理成悬浮液后,将细胞稀释成2×106cells/ml。各取出1ml植入6孔培养盘中,使每孔约含2×106个细胞,放入5%CO2培养箱中37℃培养。次日,细胞生长形成单层细胞(monolayer)后,倒掉培养液,更换新鲜培养液后备用。同时各孔加入estradiol或progesterone(stocksolution浓度各为10μg/ml、100μg/ml)(13)1μl后24h,再加入中药(stocksolution浓度为10mg/ml)10μl使浓度成为100μg/ml。24h后冲下细胞,离心(12000r）20min去上清液后加RIPA30μl备用。第一组Estradiol(10ng/ml)；第二组Estradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三组Estradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四组Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五组Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六组对照组。

2.7Westernblot分析法［10，11］利用BioquantProtein(200μl)将细胞萃取物定量,按比例取出加入proteindye3μl。将Totalproteinloading至10%SDS-PSGE后,以80V电泳3h,利用电转印槽(Electrotransfertank)以270mA1h,将蛋白质面SDS-PAGE转至PVGEmembrane后,加入Blockingsolution(1%BovineserumBSA)1h,分别加入Bcl-2rabbitpolyclonalIgG,α-tubulinmousemonoclonalIgM(1∶1000)4℃置1夜,再以PBST清洗,分别加入anti-rabbitIgG和anti-mouseIgG(1∶5000)1h后,再以PBST清洗后加呈色剂至呈色为止,再以清水洗去呈色剂后晒干。

2.8半致死量浓度(Theconcentrationof50%inhibition,IC50）之测定实验前将冷冻干燥之各种药品分别经称2、4、6、8、10、12、14、16mg以DMSO1ml溶解,再用研钵细磨后,以0.22μlmicrofilterunit过滤,分别调至成不同浓度之stocksolution。每well加入stocksolution2μl于含198μl培养基中,使最后中药浓度为40、80、120、160、200、240、280、320mg/ml。第二天观察细胞生长情形,进行Tetrazolium反应法(MTTassay,计算其IC50）。

2.9细胞毒杀百分率之计算公式CI%=1-(实验组之OD值/对照组之OD值）×100%。

2.10统计学方法各药物之抑制率分别以平均标准偏差(Mean±SD)表示之,统计皆用student’st-test方法计算。

3实验结果

单味药对子宫肌瘤细胞和正常细胞毒性百分比(CytotxicityIndex)之比较;在20种单味药中，王不留行、吴茱萸、生鸡内金、水蛭(100μg/ml)对子宫肌瘤的细胞毒性百分比(CytotoxityIndex)较正常细胞高很多,见表2～4、图1。

图1中药对子宫肌瘤细胞毒性百分比

表2单味药对正常细胞和子宫肌瘤细胞的细胞毒性百分比（略）

表3王不留行对不同浓度子宫肌瘤细胞毒性百分比（略）

表4王不留行对子宫肌瘤细胞之IC50略

半致死量浓度在不同细胞之测定结果,王不留行汲水置在子宫肌瘤细胞的浓度,都小于正常细胞的浓度,显示子宫肌瘤细胞对于这些中药较为敏感,也较正常细胞有效。

Bcl-2蛋白质Westernblot分析法结果：正常子宫细胞和子宫肌瘤细胞在Estradiol(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2的变化。Myometriumcell和Myomacell的第二组比第三组颜色较淡,第五组比第四组颜色较淡,显示Bcl-2较少。子宫肌瘤中Bcl-2protein受Progesterone(100ng/ml)刺激而增加,受Estradiol(10ng/ml)刺激而减少,因此第四组颜色要比第三组深,Bcl-2显示溶媒对实验结果影响不大,正常子宫细胞和子宫肌瘤细胞各有六组;第一组Etradiol(10ng/ml)；第二组Etradiol(10ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第三组Etradiol(10ng/ml)+DMSO10μl；第四组Progesterone(100ng/ml)+DMSO10μl；第五组Progesterone(100ng/ml)+王不留行(100μg/ml)；第六组对照组。

子宫肌瘤细胞加入王不留行的Bcl-2测定：正常子宫细胞和子宫肌瘤细胞在Estradio(10ng/ml)和Progesterone(100ng/ml)加入王不留行(100μg/ml)后,Bcl-2蛋白质的变化Myometrium和Myomacell的Westenblot第二组。第五组色较淡,显示Bcl-2较少。

4讨论

在本实验中单味药三菱、莪术、生鸡内金、水蛭对子宫肌瘤的细胞毒性百分比反而比正常细胞较低。三菱、莪术辛苦,性平和,入肝、脾二经能入血分以破血瘀,又能走气分以气消积,可抑制血小板聚集及血栓形成,也可扩张血管改善微循环。生鸡内金、水蛭主术恶血、瘀血、月闭,破血瘕积聚。生鸡内金不仅能加强消积化瘀之功效,亦顾护脾胃,亦可以散血去瘀、消肿定痛,水蛭会产生类似前列腺环素(prostacyclin,PGI2)可抑制血小板凝集、降低血压并释放出胞浆素原(plaminogen)［12］。

王不留行有催乳通经、消肿

【关键词】吴茱萸

【摘要】目的观察单味中药对子宫肌瘤之影响。方法应用terazolium(MTT)反应法,针对传统中药以50%乙醇之萃取物进行子宫肌瘤细胞生长抑制试验。结果发现20种单味中药(吴茱萸,王不留行,水蛭等)对子宫肌瘤细胞抑制率较正常子宫细胞明显增高。结论子宫肌瘤细胞半致死量浓度(IC50)之测定,较正常子宫细胞为低,显示这些中药对子宫肌瘤细胞较为敏感,应可经由细胞凋亡的途径,而抑制子宫肌瘤细胞生长。

【关键词】王不留行；吴茱萸；水蛭；生黄芪；子宫肌瘤细胞；细胞凋亡