大鼠脑组织表达管理论文

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【摘要】目的观察铝负荷大鼠脑组织单胺氧化酶B(MAOB)的活性与表达改变，并探讨尼莫地平对该动物模型的影响。方法采用三氯化铝（AlCl3）(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持续3个月，建立铝负荷致大鼠慢性脑损伤的动物模型，尼莫地平(80mg/kg)在每次铝给予4h后灌胃，观察行为学、生化酶学、MAOBmRNA及蛋白表达水平等指标的变化。结果铝负荷能明显导致大鼠被动回避性学习记忆能力和空间识别能力障碍，使其脑组织乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性显著降低(P＜0.01)，而胆碱酯酶(AchE)活性显著升高(P＜0.01)，超氧化物歧化酶（SOD）活性显著降低(P＜0.01)，而丙二醛（MDA）含量显著升高(P＜0.01)，MAOB活性与MAOBmRNA及蛋白表达水平显著增加(P＜0.01)；NMDP能明显改善铝负荷大鼠的学习记忆能力障碍，明显阻遏铝负荷大鼠海马组织ChAT与SOD活性的降低，AchE活性与MDA含量的增高，MAOB活性及其mRNA与蛋白表达的增加。结论铝负荷致大鼠脑损伤涉及脑组织的MAOB活性与表达改变；NMDP可能降低铝负荷大鼠脑组织MAOB表达和活性，并增加SOD活性，减少自由基而保护大鼠慢性脑损伤。

【关键词】尼莫地平；铝负荷大鼠；单胺氧化酶B

由于阿尔茨海默病（AD）发病机制未明，目前尚缺乏理想的治疗手段。尼莫地平是双氢吡啶类钙通道拮抗剂，脂溶性高，易通过血脑屏障，其扩张脑血管，改善脑血供应等作用已得到肯定并应用于临床，而其对老年痴呆认知记忆障碍的改善作用〔1〕，机制至今仍不很清楚。有研究报道单胺氧化酶B（MAOB）的活性改变与神经元损伤和神经元退变可能有密切关系〔2，3〕。为探讨尼莫地平在改善老年痴呆等导致的认知记忆障碍中的作用，本研究拟采用铝负荷大鼠脑损伤模型，观察脑损伤学习记忆障碍与脑组织MAOB改变的关系及尼莫地平对铝损伤大鼠脑组织MAOB表达的影响，为神经元退行性疾病的发病机制研究奠定实验与理论基础，为防治药物的开发探寻新方法与新途径。

1材料与方法

1.1动物与分组清洁级3月龄Wistar大鼠100只，雄性，180～220g，由重庆医科大学动物实验中心提供〔动物生产许可证号:SCXK(渝)2005002〕。按体重随机分成3组，每组10只，即空白对照(溶剂为0.5%羧甲基纤维素钠)组，铝模型(AlCl3400mg/kg)组与尼莫地平组(80mg/kg)，灌胃容积1ml/100g体重。在实验过程中，铝模型组死亡2只鼠。

1.2方法

1.2.1试剂、药品与仪器AlCl3·6H2O和葡萄糖酸钠为国产分析纯，临用前用蒸馏水配制；尼莫地平(重庆科瑞制药厂)，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠配制；乙酰胆碱转移酶(ChAT)、胆碱脂酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、MAOB试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RTPCR试剂盒（日本TaKaRa）、RNATriol、单去污剂裂解液、考马斯亮蓝、封闭液与辣根过氧化物酶等。DTT2型大鼠跳台仪(中国医学科学院药物研究所)、DMS2型电脑全自动程控Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)、高速冷冻离心机(美国Sigma公司)、UV265紫外分光光度计(日本岛津公司)、PCR扩增仪(美国genecycleTM，BioRad公司)与凝胶电泳成像分析系统(美国BioRad公司)等。

1.2.2模型制备采用AlCl3(400mg/kg)灌胃大鼠，1次/d，5d/w，持续3个月，建立铝负荷致大鼠慢性脑损伤的动物模型。

1.2.3检测指标

1.2.3.1训练次数与跳台潜伏期分别在给予药物3月后次日，用跳台法测定每组大鼠被动回避性学习记忆能力。先将动物放入反应箱中适应1min，然后通以电压为36V的交流电5min，大鼠遭受电击会跳上安全平台，而走下平台后会再次遭受电击，记录5min内大鼠受电击次数，作为大鼠学会逃避电击的学习能力。24h后测定大鼠的记忆成绩，把大鼠置于安全平台上，记录大鼠第一次跳下平台的时间即潜伏期，以此潜伏期作为大鼠的记忆成绩，超过5min记为5min。

1.2.3.2寻台潜伏期每组大鼠在完成被动回避性学习记忆能力测试后，用Morris水迷宫法进行大鼠空间定向能力测试。水温24～25℃。整个训练过程分为2个阶段：第1阶段，第1次训练时将大鼠放到平台上适应1min，后让其自由游泳至平台，3min内未找到平台者，实验者协助将其引至平台，从第2天起，每天分上、下午分段训练，每段训练4次，每次训练时选择1个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，让大鼠进行定向航行，持续训练4d；第2阶段，即在第5天时进行测试，撤去平台，并任意将大鼠从最后一次训练时的入水方位放入，电脑记录大鼠第1次跨越原平台的时间即寻台潜伏期(Stepdownlatency，SDL)，以此潜伏期作为大鼠的空间定向能力成绩，超过2min以2min计算。

1.2.3.3脑组织ChAT、AchE、SOD活性和MDA含量测定在完成全部行为学测试后，处死大鼠，分离其海马，用生理盐水做成10%匀浆，按相关试剂盒说明书进行具体操作。

1.2.3.4脑组织MAOB活性、mRNA及蛋白表达水平的检测10%海马及皮质组织匀浆各取0.1ml，按照MAOB试剂盒说明书中的操作步骤测定MAOB活性。参照大鼠MAOB基因库，根据cDNA设计引物，引物由北京鼎国生物技术发展中心合成，用来扩增535bp的MAOB片段。另外从北京鼎国生物技术发展中心购买GAPDH引物一对作为内参照，用来扩增983bp的GAPDH片段。MAOB的上游引物为5′TGCTAGATAAGATCTGCTGG3′；下游引物为5′ATCCAATGTGTACGCAATTG3′；GADPH的上游引物为5′TGAAGGTCGGTGTCAACGGATTTGGC3′；下游引物为5′CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC3′；PCR反应条件为95℃5min预变性，95℃1min、60℃55s与72℃90s，27个循环，72℃10min。扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳，BioRad凝胶成像分析系统成像与分析。Western印迹测定MAOB蛋白表达水平，以βactin为参照，辣根过氧化物酶系统显色，用可见紫外光凝胶扫描分析系统对蛋白条带进行分析。

1.3统计学处理结果用x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行方差分析，组间差异采用Dunnett方法进行显著性检验。

2结果

2.1铝负荷大鼠脑组织生化指标的变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝模型组大鼠脑组织的ChAT与SOD活性明显降低，AchE活性与MDA含量显著增高（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠脑组织的ChAT与SOD活性明显增加，AchE活性与MDA含量显著降低（均P＜0.01）（表1）。

2.2铝负荷大鼠学习记忆功能的变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝模型组大鼠5min内学会逃避电击而需要的电击次数明显增加，而跳台潜伏期明显缩短，寻台潜伏期明显延长（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠学会逃避电击而需要的次数明显减少(P＜0.01)，而跳台潜伏期明显延长，寻台潜伏期明显缩短（均P＜0.01）（表2）。

2.3铝负荷致大鼠脑组织MAOB活性与表达变化及尼莫地平的影响与空白对照组比较，铝负荷组大鼠脑组织MAOB活性与MAOBmRNA及蛋白表达均显著增高（均P＜0.01）。与铝模型组比较，尼莫地平组大鼠脑组织MAOB活性与MAOBmRNA及蛋白表达均显著降低（均P＜0.01）（表3）。表1尼莫地平对铝负荷大鼠脑组织ChAT、AchE、SOD活性与MDA含量的影响表2尼莫地平对铝负荷致大鼠学习记忆能力与空间识别能力损害的影响与铝模型组比较：1）P＜0.01，下表同表3尼莫地平对铝负荷大鼠脑组织MAOB活性与表达的影响

3讨论

转基因方法可以建立AD大鼠模型，并能较好地模拟AD特征改变，但建模时间长，成本昂贵，很难广泛用于研究〔4〕。动物脑室注射、腹腔给予或者长期口服铝盐，铝可在脑皮层各区以及海马异常沉积，引起动物学习记忆功能的进行性损害和神经元退变〔5〕。因此，本室采用AlCl3(400mg/kg)持续灌胃大鼠的方法，建立铝负荷致大鼠慢性脑损伤模型。ChAT的表达和活性降低以及AchE活性的升高会造成乙酰胆碱含量下降，进而出现学习记忆功能障碍。因此ChAT和AchE表达和活性改变是AD等神经元退行性疾病特征变化之一。本研究中，铝模型组大鼠脑组织ChAT活性降低，AchE活性升高，同时大鼠被动回避性学习记忆能力与空间识别能力损害，故此法建立神经元退变大鼠模型是成功的。

关于铝致神经毒性，特别是致神经元退变的机制，目前尚不完全清楚。本实验结果显示，慢性铝负荷可导致大鼠海马SOD活性降低、MDA含量升高，提示与其他原因所致脑损伤相似，氧化应激也参与了慢性铝负荷致脑损伤、神经元退变过程。

本实验发现铝负荷大鼠脑组织MAOB活性、MAOBmRNA与蛋白表达显著增高，提示铝负荷致大鼠神经元退变的毒性机制也与MAOB活性及表达增加有关。

本结果还发现，尼莫地平能明显改善铝负荷导致的大鼠被动回避性学习记忆能力损害和空间学习记忆障碍，减轻海马神经元损伤，明显增加铝负荷大鼠海马ChAT与SOD的活性，明显降低铝负荷大鼠AchE活性与MDA含量，表明尼莫地平对铝负荷大鼠脑损伤具有保护作用；同时，尼莫地平也能显著降低铝负荷大鼠脑组织MAOB活性，对抗铝负荷引起的大鼠脑组织MAOBmRNA和蛋白表达增加。但尼莫地平对MAOB活性与表达的改变是该药物直接作用引起，还是作为钙通道拮抗剂间接作用所致，尚不清楚，有待深入研究。

【参考文献】

1王玮,付晶晶.尼莫地平的药理作用及临床应用〔J〕.沈阳医学院学报，2000;2(2):1147.

2KurthJH，KurthMC，PodusloSE,etal.AssociationofamonoamineoxidaseBallelewithParkinson′sdisease〔J〕.AnnNeurol,1993;33（4）:36872.

3YangJQ，ZhouQX.Protectiveeffectofnimodipineagainstcerebralinjuryinducedbysubacutecarbonmonoxideintoxicationinmice〔J〕.ActaPharmacolSin，2001;22(5):42337.

4HsiaoK，ChapmanP，NilsenS,etal.Correlativememorydeficits，A8elevation，andamyloidplaquesintransgenicmice〔J〕.Science,1996;274(5284):99102.

5林巧，曹云鹏.长期经口铝摄入对大鼠记忆行为的影响〔J〕.中国临床康复，2003;7(25)：34467.