大鼠急性肺损伤分析论文

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【摘要】目的观察K252a（MLK3阻断剂）对内毒素性急性肺损伤大鼠肺病理组织学改变及生存率的影响。方法采用尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）复制内毒素性急性肺损伤模型。90只大鼠随机分为6组（n=15）：对照组(control组)、LPS组、K252a50μg/kg组（K50组）、K252a75μg/kg组（K75组）、K252a100μg/kg组（K100组）和溶剂对照组（DMSO组）。模型制备成功后6h取肺脏进行光镜检查，观察48h内大鼠死亡情况并比较累计生存率。结果48h内LPS组、K50组、K75组和K100组以及DMSO组大鼠生存率分别为6.3%、27%、72%、57%及6.7%。光镜下可见LPS组大鼠肺组织结构明显被破坏，主要表现为肺泡内出血、肺间质水肿、肺泡萎陷以及肺组织内大量炎性细胞浸润。与LPS组相比，预先应用K252a组肺组织的损伤程度较轻微、肺间隔轻度增宽、无明显出血、少量炎性细胞浸润，尤其K75组，减轻程度最明显。结论K252a延迟LPS大鼠死亡时间，并呈现剂量依赖性，75μg/kgK252a剂量可以明显提高其生存率。并可改善内毒素性急性肺损伤大鼠肺脏的病理组织学结果。

【关键词】K252a;MLK3;内毒素;急性肺损伤；大鼠;生存率

ProtectiveeffectsofK252aonendotoxin-inducedacutelunginjuryinrats

endotoxin-inducedacutelunginjuryinrats

ZHANGMaoyin1,CHENLong1,CHENGQin1,ZHANGWenwen1,LIUSu2,WANGGuanglei2,LIUGongjian2

(1.JiangsuProvinceKeyLaboratoryofAnesthesiology,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China;

2.DepartmentofAnesthesiology,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofK252a(MLK3blocker)onthepathohistologicalchangesinthelungsandthesurvivalrateinratswithendotoxin-inducedacutelunginjury.MethodsRatsmodelsofacutelunginjurywereestablishedbyadministrationoflipopolysaccharide(LPS)asendotoxininthecaudalvein.90healthymaleSprague-Dawleyratswererandomlydividedinto6groups(n=15):controlgroup,LPSgroup,K252a50μg/kggroup(K50),K252a75μg/kggroup(K75),K252a100μg/kggroup(K100)andvehiclecontrolgroup(DMSO).Eachgroupwassampled6hafteradministrationofLPSforlightmicroscopyexamination.Thedeathsduring48hineachgroupwereobservedandtheaccumulatedsurvivalrateswerecompared.ResultsWithin48hours,thesurvivalratesofLPSgroup,K50group,K75group,K100groupandDMSOgroupwere6.3%,27%,72%,57%and6.7%,paredwiththecontrolgroup,inLPSgroup,lightmicroscopyrevealedobviousdamagetolungtissues,characterizedbyalveolarhemorrhage,pulmonaryinterstitialedema,paredwithLPSgroup,theK252agrouphadmildhistologicalinjurytolungtissues,withslightthickeningofalveolarseptaandnoevidenthemorrhage,andmildinflammatorycellinfiltration.InK75group,inparticular,thereliefwasmostnoticeable(P<0.05).ConclusionK252acanretardthedeathofLPS-injectedratswithdosedependenceandrelievetheendotoxin-inducedacutelunginjuryinrats.

Keywords:K252a;MLK3;lipopolysaccharide;acutelunginjury;rats;survivalrate

急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ARDS）是临床常见的危重病，是重症监护治疗的重要课题。其本质是以炎症介质过度释放为特征的肺部广泛炎症反应［1］。由于ALI/ARDS病因与发病机制的复杂性，近年来尽管进行了大量的研究，但其病死率仍居高不下［2］。因此深入了解并研究ALI/ARDS的发病机制，具有重要意义。本实验采用大鼠尾静脉注射LPS复制内毒素性急性肺损伤模型，应用p38MAPK上游MLK3的抑制剂K252a对内毒素性急性肺损伤大鼠进行干预，观察其对大鼠肺脏病理组织学改变及生存时间的影响，旨在探讨K252a对急性肺损伤有无保护作用，从而为抗炎治疗增添一条新的途径，还有助于寻找对ALI/ARDS更有效的治疗方法。

1材料和方法

1.1实验动物及试剂成年雄性SD大鼠，体重200～250g，购自中国科学院上海实验动物中心。LPS（E.coli，011:B4）、K252a、DMSO（dimethylsulfoxide，二甲基甲酰胺）均购自美国Sigma公司。

1.2模型制备和分组实验动物随机分为6组（n=15）：对照组（Control组），仅注射生理盐水；LPS组，经尾静脉注射LPS5mg/kg；K252a50μg/kg组（K50组）、K252a75μg/kg组（K75组）和K252a100μg/kg组（K100组），分别在注射LPS前30min尾静脉注射K252a50μg/kg、75μg/kg、100μg/kg；溶剂对照组（DMSO组）在注射LPS前30min尾静脉注射DMSO0.2ml。本实验中所选用药物剂量及给药方式是依参照文献［3］、［4］及我们的预实验结果而定。

1.3病理学检查注射LPS后6h取适量肺组织，经4%甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片，苏木精-伊红染色后，光镜下观察病理改变。

1.4生存率分析为了证实K252a对急性肺损伤的保护作用，观察各组大鼠48h内的生存情况。

1.5统计学分析所有数据均以±s表示，统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Student′st检验。死亡率分析采用Kaplan-Meier检验。P<0.05认为有统计学意义。所有统计均由SPSS13.0统计软件处理完成。

2结果

2.1病理学检查见图1。与对照组相比，LPS组大鼠肺组织的结构破坏明显，主要表现为肺泡内出血、肺间质水肿、肺泡萎陷以及肺组织内大量的炎性细胞浸润（图1-B）。与LPS组相比，预先应用K252a各组大鼠肺组织的损伤程度减轻，表现为肺间隔轻度增宽、无明显出血、少量炎性细胞浸润（图1-D、1-E、1-F），尤其K75组，减轻程度最明显。

2.2生存率分析见表1。与LPS组相比，K75组的生存率明显提高(P<0.05)，而DMSO组与LPS组之间的生存率差异无显著性。这表明K252a能够限制LPS的致死率，尤其是75μg/kg剂量组。表1各组平均生存时间及生存率比较

3讨论

ALI/ARDS的发生发展是一个复杂的过程，涉及了许多信号转导途径。在以往的研究中，人们都将注意力放在NF-κB信号通路上，因为该通路可以诱导多种炎性细胞因子的表达。然而，ALI/ARDS发生发展是一个复杂的过程，涉及了许多信号转导过程，不仅有NF-κB信号通路，还有许多其他激酶通路。近年来，大量的离体研究显示，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）家族均参与调节了炎性介质的产生，且参与了机体炎症反应的发生与发展。如p38MAPK、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）等，其中，p38MAPK被认为是在应激信号传递中最重要的调节者之一，在调节细胞的凋亡以及细胞因子的产生中发挥着重要的作用。Kim等［5］曾报道p38MAPK参与调节了人肺血管内皮细胞中TNF-α诱导的IL-8的产生。还有证据显示p38MAPK参与了LPS诱导的中性粒细胞中NF-κB的核转位。p38MAPK介导了LPS引起的支气管收缩和中性粒细胞的聚集。

由于p38MAPK的特异性抑制剂——SB203580的发现，又为研究p38MAPK的细胞内信号通路提供了一个有效的工具。据报道，在LPS刺激的单核细胞中，TNF-α和IL-1的产生与p38MAPK的活化密切相关［6］。还有报道指出p38MAPK抑制剂SB203580预处理可下调大鼠细胞黏附分子ICAM-1的表达，减轻肺组织的病理损害，能起到防治ALI的作用。最近，又有研究［7］表明，巨噬细胞的糖皮质激素受体通过选择性抑制p38MAPK来抑制toll样受体介导的炎症反应。此外，p38信号通路还参与了大鼠急性重症胰腺炎所导致的急性肺损伤的发生，抑制p38MAPK，能明显地降低其肺损伤的程度［8］。尽管大量研究显示，p38MAPK信号通路对炎症介质的调节起着重要的作用，但是有关p38MAPK信号通路对LPS导致的ALI的调节作用的在体研究还很少，并且，其作用机制也尚未明确。

本实验中我们探讨了人为阻断MLK3-MKK3/6-p38MAPK信号通路对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的影响，选择K252a作为MLK3的抑制剂。本研究发现：K252a能延迟内毒素诱导急性肺损伤大鼠的死亡时间，并呈剂量依赖性，K252a75μg/kg剂量组可明显提高其生存率，并能明显改善内毒素性急性肺损伤大鼠肺脏的病理组织学结果。提示K252a对内毒素诱导急性肺损伤大鼠有保护作用，其机制可能是：抑制MLK3的磷酸化能有效地阻止LPS引起的肺损伤的级联反应。

在此基础上，我们认为，p38MAPK信号通路的活化可能是急性肺损伤发生发展的机制之一，在信号通路水平阻断和调控MLK3及p38MAPK的表达和活性，将可能成为治疗急性肺损伤的一条新途径。而且尤为重要的是，MLK3抑制剂可能比p38MAPK抑制剂更具有临床应用前景，其更加强对休克、创伤、感染、炎症的早期处理，以消除产生过度炎症反应的条件，否则一旦病情发展到失控性炎症反应阶段，现有的一切手段都会显得苍白无力。

【参考文献】

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