缺血性脑损伤管理论文

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【摘要】目的观察HPK1对SD大鼠全脑缺血/再灌注后海马CA1区锥体细胞的作用。方法采用四动脉结扎法建立大鼠全脑缺血模型,缺血15min后分别灌注30min、3h、6h、24h、3天和5天。大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注组、缺血/再灌注给药组和缺血/再灌注溶剂对照组。缺血/再灌注给药组再分为2组，分别脑室注射100g/L的HPK1AS-ODNs、HPK1MS-ODNs，每24h注射1次，连续3天，在最后一次注射24h后行四动脉结扎全脑缺血。使用免疫沉淀和焦油紫染色法等技术检测相关信号蛋白的表达、活化水平及神经元细胞的死亡。结果在大鼠海马神经元中有HPK1的表达，脑室注射AS-ODNs大鼠海马CA1区存活锥体细胞明显增多。结论HPK1反义寡核苷酸对缺血/再灌注引起的海马神经元凋亡具有保护作用。

【关键词】造血祖细胞激酶1;反义寡核苷酸;海马；凋亡；大鼠

TheroleofHPK1inischemicbraininjury

LITing,ZHANGGuangyi*

(ResearchCenterforBiochemistryandMolecularBiology,JiangsuKeyLaboratoryofBrainDisease

Bioinformation,XuzhouMedicalCollege,Xuzhou,Jiangsu221002,China)

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheroleofHPK1inthepyramidalcellsinCA1regionoftherathippocampusafterbrainischemia/reperfusion.MethodsTransientbrainischemia(15min)andreperfusionwasinducedbythefour-vesselocclusionmethod(4-VO)toestablishratbrainischemiamodel,followedbyreperfusionof0min,30min,3h,6h,24h,3dand5d,respectively.Ratswererandomlyassignedto4groups:sham-operationgroup,ischemia/reperfusiongroup,drugtestgroupandvehiclecontrolgroup.Thedrugtestgroupwasinjectedwith100g/LHPK1AS-ODNs，MS-ODNsintothecerebralventricle,every24hfor3days,and24hafterthefinaladministrationwassubjectedto4-VO.Immunoprecipitationandcresylfastvioletstainingwereemployedtodetecttheexpressionofrelevantmessageproteins,activationandthedeathofthehippocampalneurons.ResultsItwasfoundthatHPK1wasexpressedinrathippocampusneurons.ConclusionsAdministrationofHPK1antisenseoligodeoxynucleotidescansignificantlyprotecthippocampusneuronsfromapoptosiswithoutdose-dependence.

Keywords:HPK1;antisenseoligodeoxynucleotide;hippocampus;apoptosis;rat

造血祖细胞激酶1（hematopoieticprogenitorkinase1，HPK1orMAP4K1）是造血系统特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于哺乳动物Ste20相关蛋白激酶的MAP4K家族［1］。HPK1主要在造血组织和细胞中表达。大量研究结果表明，HPK1参与许多信号级联反应，包括MAPK(mitogen-activatedproteinkinase)信号、抗原受体信号、凋亡信号、生长因子信号以及细胞因子信号等。HPK1存在3种激活方式，即丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化或酪氨酸磷酸化，Ling等［2］证明HPK1含有13个潜在的酪氨酸磷酸化位点，在造血系统内当其中某些酪氨酸磷酸化位点被ZAP-70(Zeta-chain-associatedproteinkinase70)激活后，HPK1将提供含有SH2结构域的蛋白质锚定位点。当HPK1的379位（小鼠）/381位（人类）酪氨酸残基被磷酸化而激活后，HPK1具有了和SLP-76（SH2domain-containingleukocyteproteinof76kD）结合的能力。当HPK1被完全激活后，它可以选择性地激活JNK(c-JunNH2-terminalkinase)的MAPK信号通路［3］。1996年应用PCR技术将HPK1从小鼠造血祖细胞中克隆出来后，研究表明HPK1主要在造血组织和细胞中表达，目前对于HPK1的研究主要集中在造血系统。本研究旨在探讨HPK1是否存在于大鼠海马神经元中及其在缺血性脑损伤中的作用。

1材料和方法

1.1实验动物及材料清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体重250～300g，徐州医学院实验动物中心提供。

anti-HPK1（一抗）由SantaCruz公司提供；二抗（驴抗羊）和标准牛血清白蛋白购自美国Sigma公司。醋酸纤维膜（NC膜）为AmershanBiosciences公司产品；NBT/BCIP为Promega公司产品；其他试剂为国产分析纯。

电动匀浆器购自美国Glas-Col公司，Z252MK台式高速冷冻离心机购自德国HERMLE公司。

HPK1反义寡核苷酸序列（AS-ODNs）5′-AGGGTCCACGACGTCCATCC-3′、HPK1错义寡核苷酸序列（MS-ODNs）5′-CACAGCGTCGTACCCGCAGT-3′由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2四动脉阻断全脑缺血模型按Pulsinelli法［4］进行。

1.3动物分组及处理随机分组：①Sham组，手术不缺血；②脑缺血/再灌注组（I/R组），脑缺血15min后再灌注30min、3h、6h、24h、3天、5天；③溶剂对照组（TE组），脑室注射Tris-EDTA，连续3天，在最后一次注射24h后进行缺血/再灌注；④错义寡核苷酸组（MS组），脑室注射MS-ODNs，方法同TE组；⑤反义寡核苷酸组（AS组），脑室注射AS-ODNs，方法同TE组。

1.4脑室注射参照文献［5］方法。

1.5海马CA1区HPK1检测

1.5.1样品制备大鼠缺血15min再灌注30min、3h、6h、24h、3天和5天时，断头快速取脑，分离双侧海马。按文献［6］方法制备海马CA1区组织总蛋白。

1.5.2蛋白含量测定按Lowry等［7］方法，以牛血清白蛋白为标准蛋白。

1.5.3免疫印迹法蛋白样品（50μg/L）经SDS-PAGE分离后，以半干转法转移至NC膜，室温封闭4h(1﹪BSA,10mmol/LTris，10mmol/LNaCL，0.1﹪Tween20)，加入一抗，4℃过夜。用洗涤液洗膜，加入相应二抗，37℃保温2h，封闭液洗膜。以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。

1.6缺血/再灌注5天海马CA1区组织学观察大鼠脑海马CA1区组织学切片制备参照文献［6］方法。

在高倍镜下观察海马CA1区神经元，有清楚的细胞核、胞体着色良好的计为存活神经元，神经元存活程度以CA1区1mm长度内成活的大锥体神经元数量表示。

1.7统计学处理数据以±s表示，2组间数据比较采用新复极差法，多组间数据比较采用单因素方差分析（AZOVA）,P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠脑缺血/再灌注不同时间的HPK1免疫印迹分析结果如图1所示，在缺血/再灌注不同时间海马CA1区都可以检测到HPK1的表达。

2.2缺血/再灌注5天后海马CA1区组织学观察Sham组海马CA1区锥体细胞核圆而苍白；I/R组海马CA1区锥体细胞胞体皱缩，细胞核固缩；AS组锥体细胞形态保持较好。图2。

（焦油紫染色，×40，×400）AS组海马CA1区存活的神经元数量较I/R组、TE组、MS组明显增多；I/R组、TE组、MS组海马CA1区存活的神经元数量相近（P＞0.05）。见图3。

3讨论

HPK1是一个97×103的丝/苏氨酸蛋白激酶，它在淋巴细胞中对于调节JNK细胞信号通路起着重要的作用［1］。大量的研究结果证明，HPK1主要在造血组织和器官中表达。但在神经系统中HPK1起着什么样的作用至今未见报道（网络检索）。HPK1的N末端由1个Ste-20样激酶结构域、4个脯氨酸富集motif、1个caspase切割位点组成，C末端为1个Citron同源结构域［2］。Hu等［8］发现造血祖细胞瞬时表达HPK1可以通过MLK3-MKK4/7-JNK信号通路激活JNK，但不能激活ERK或p38-MAPK信号通路。Kiefer等［1］报道HPK1可以通过它的第3和第4个脯氨酸富集区与MLK3的SH3结构域相互作用。在体外实验中，HPK1通过磷酸化MLK3的丝氨酸281位而激活MLK3继而激活JNK。本室早期的研究结果也证实MLK3在大鼠瞬时脑缺血中发挥着重要作用，在缺血15min再灌注6h时其磷酸化水平达到高峰［5-6］。于是，我们提出HPK1是否也参与了脑缺血/再灌注所引起的神经元死亡的细胞信号转导通路呢？

因此，我们首先通过免疫沉淀技术检测了在大鼠海马神经元细胞中HPK1的表达。结果证实在大鼠海马神经元细胞中存在HPK1的表达。既然HPK1在大鼠海马神经元细胞中有表达，那么它有何作用呢？为了回答这一问题，我们设计了HPK1的反义寡核苷酸（HPK1AS-ODNs），脑室注射HPK1AS-ODNs预处理组大鼠海马神经元与I/R组相比明显降低了脑缺血/再灌注所诱导海马神经元死亡。以上结果证明，HPK1存在于大鼠海马神经元，并且HPK1AS-ODNs对缺血/再灌注所引起的CA1区神经元缺失有保护作用。

本实验首次在整体水平证实HPK1存在于大鼠海马神经元细胞中，并且发现我们设计的HPK1的反义寡核苷酸对于对缺血/再灌注所引起的CA1区神经元缺失有保护作用。这对今后我们进一步研究HPK1在全脑缺血中的作用及其分子机制提供了新的思路。

【参考文献】

［1］KieferF,TibblesLA,AnafiM,etal.HPK1,ahematopoieticproteinkinaseactivatingtheSAPK/JNKpathway［J］.EMBOJ,1996,15(24):7013-7025.

［2］LingP,YaoZ,MeyerCF,etal.Interactionofhematopoieticprogenitorkinase1withadapterproteinsCrkandCrkLleadstosynergisticactivationofc-JunN-terminalkinase［J］.MolCellBiolo,1999,19(2):1359-1368.

［3］ArnoldR,LiouJ,DrexlerHC,etal.Caspase-mediatedcleavageofhematopoieticprogenitorkinase1(HPK1)convertsanactivatorofNFkappaBintoaninhibitorofNFkappaB［J］.JBioloChem,2001,276(18):14675-14684.

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［6］PeiDS,SunYF,GuanQH,etal.Postsynapticdensityprotein95antisenseoligodeoxynucleotidesinhibitstheactivationofMLK3andJNK3viatheGluR6.PSD-95.MLK3signalingmoduleaftertransientcerebralischemiainrathippocampus［J］.Neuroscienceletters,2004,367(1):71-75.

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［8］HuMC,WangY,QiuWR,etal.Hematopoieticprogenitorkinase-1(HPK1)stressresponsesignalingpathwayactivatesIkappaBkinases(IKK-alpha/beta)andIKK-betaisadevelopmentallyregulatedproteinkinase［J］.Oncogene,1999,18(40):5514-5524