他克莫司血药浓度方法学评论

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他克莫司(tacrolimus,FK506)是一种新型强效免疫抑制剂,是链霉菌属中分离出来的发酵产物,常温下呈白色结晶状粉末,分子式为CH60N2HO,分子量为822.05[1]。由于对T细胞有选择抑制作用,主要用于抗器官排斥性疾病肝、肾移植的急性排斥反应或是免疫性疾病类风湿性关节炎、红斑狼疮等疾病,药物本身和其代谢产物都具有一定的毒性,所以进行血药浓度监测是其使用的一个必备前提。目前监控其血药浓度的方法有许多,但是高效液相色谱法尚未成体系。本文采用反相高效液相色谱法测定他克莫司血药浓度[2],方法准确、可靠、简单,适用于临床上监测他克莫司的血药浓度的广泛推广。2011年2月～2011年6月,我们研究了使用反相高效液相色谱法测定他克莫司血药浓度的可行性。

1材料与方法

1.1材料

仪器与药品仪器:3200Qtrap型液相色谱一串联质谱仪;药品:他克莫司胶囊(规格为1mg/粒,浙江海正药业股份有限公司,批号:20100412);他克莫司对照品(上海同田生物技术有限公司批号:084120L);乙腈为色谱纯,其它试剂为分析纯。

1.2方法

1.2.1色谱条件:色谱柱:DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm×5μm);流动相:乙腈:0.2%磷酸:四氢呋喃(55:40:5);流速:1.2ml/min;柱温:30℃;进样量:20。

1.2.2样品溶液的配制:精密称取他克莫司10mg,全部转移至100ml容量瓶中,加入乙腈至刻度摇匀,制成0.1mg/ml的溶液,放入冰箱保存。

1.2.3标准溶液的配制:精密称取他克莫司对照品10mg,全部转移至l00ml容量瓶中,加入乙腈至刻度,摇匀,即得浓度为0.1mg/ml的标准品对照液。分别取标准品2、4、6、8、10ml,用乙晴稀释至20ml,做成标准曲线。

1.2.4全血样品处理:取血清0.5ml,加入5ml乙醚,振荡3min,3000r/min离心机处理10min,将上清液转移至另一管中,留待进样。

1.2.5配制好的液体每次进样20μl,每一浓度进样三次,如结果无太大偏差,取其平均值。以峰面积(A)对浓度(C)进行回归,他克莫司的浓度在1.32~16.0μg/ml范围内线性关系良好。

2结果

2.1回收率

取空白血浆1ml,加入他克莫司标准液,配成2.0、4.0、6.0三种梯度浓度的血浆样品,按“1.2.4”项方法操作,测定样品峰面积,根据标准曲线计算相对回收率。根据各浓度血浆样品峰面积和相应浓度的标准液直接进样,测得的峰面积比较,通过计算得到绝对回收率。结果见表1。从表1可以看出:2.0、4.0、6.0(μg/ml)三种梯度浓度的血浆样品,相对回收率分别为104.1%、102.7%、102.8%;绝对回收率分别为93.8%、95.5%、93.0%。平均相对回收率为103.2%,平均绝对回收率为94.1%。研究结果显示:反相高效液相色谱法能够较好测定他克莫司血药不同浓度的相对和绝对回收率。

2.2精密度

配制2.0、4.0、6.0三种浓度的血浆样品,在同1d的不同时间和5d中每一天,按“1.2.4”项方法操作,测定样品峰面积,得出日内和日间精密度,见表2。从表2可以看出:.0、4.0、6.0(μg/ml)三种梯度浓度的血浆样品,日内精密度分别为104.1%、102.7%、102.8%;日间精密度分别为93.8%、95.5%、93.0%。平均日内精密度为103.2%,平均日间精密度为94.1%。研究结果显示:反相高效液相色谱法能够较好测定他克莫司血药不同浓度的日内和日间精密度。

3讨论

作为第二代免疫抑制药的代表性药物,他克莫司临床大量应用于肝肾等器官移埴的抗排斥反应及免疫缺陷性疾病,具有药效强、剂量低、提高器官存活率、急性排斥反应低等优点。但是他克莫司治疗范围限制在一定的剂量,毒副作用较大,关键是毒副作用与血药浓度呈量效正相关性,再加上其药动学指标患者个体差异较大,无法用服药量来判断血药浓度的范围[3]。因此,临床使用他克莫司治疗病症时,为提高免疫抑制效果的同时将不良反应的发生率降到最低,需要监测药物在休内的血药浓度,根据测量到的血药浓度来确定给药剂量和方案。检测他克莫司血药浓度时,通常采用全血来做为检测标本,这是因为:①全血/血浆中他克莫司浓度的分布为20:1,全血中药物浓度较高,更易达到检测灵敏度要求;②血浆浓度稳定性关,比全血浓度变异性大;③他克莫司血药浓度监测为全血谷值浓度,所以一般不用血浆。而且患者个体差异较大,血药达峰时间并不一致,所以临床检测一般以全血为主[4,5]。

有研究表明,许多因素能影响他克莫司的血药浓度[6～8],例如性别,女性的血药浓度要高于男性,体重和身高也对他克莫司的血药浓度有影响,给药时间也对他克莫司的血药浓度有很大影响,例如早晨服药,血药浓度明显高于一天的其它时间段,而服用取它的药物对他克莫司的血药浓度也有影响,例如大环内酯类药物、氯霉素、林霉素、抗真菌类药物、抗病毒药、钙拮抗剂等药物的联合用药,均会影响到他克莫司的血药浓度,所以临床上对他克莫司血药浓度的监控非常重要[9]。

近年来他莫西司的血药浓度的测定方法,主要有串联质(HPLC-MS/MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)、酶免法(EIA)及微粒子酶免分析法(MEIA)[10]。本研究采用反相高效液相色谱法测定他克莫司血药浓度,准确度高,易于操作,适于临床推广[11,12]。

我们的研究结果表明:反相高效液相色谱法能够较好测定他克莫司血药不同浓度的相对和绝对回收率,也能较好测定他克莫司血药不同浓度的日内和日间精密度。他克莫司血药浓度在1.32～16.0mg/ml范围内线性关系良好,平均加样回收率为103.2%。本研究探讨了,他莫西司的临床反相高相色谱检测法,但是对于检测他莫西司血药浓度的质控方法,并没有做探讨,质控系统的建立对于评价方法的准确及考虑其它影响检测的因素的控制十分重要。现在质控方法主要有两种,一个是定期测定样本,根据质控结果是否符合要求来确定,质控方法的正确性。另一种方法即是绘制质控图,即已测定结果为纵坐标,测定时间或者批次为横坐标,绘制标准图谱,限定有效范围。本研究的下一步即为探讨反相高相液相检测法的质控。