超声提取鱼腥草多糖分析论文

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1仪器与试药

1．1仪器电子天平（AY120，SHAMAOZUCORPOPAITIONJAPAN）、HH－6－恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）、超声波清洗器（250W，上海之信仪器有限公司）、电热鼓风恒温干燥箱（3100W，上海讯能电热设备有限公司）、UV－1800紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；双B循环水式多用真空泵（SHB－IV，郑州长城科工贸有限公司）。

1．2试药葡萄糖标准品Sigma公司产品；苯酚，硫酸、丙酮、乙醚、三氯乙酸、氢氧化钠试剂均为分析纯，医用乙醇（广州市新升华玻有限公司），苯酚试液参照文献［8］配制。

鱼腥草购于广州清平市场，经广东药学院陈幼竹博士鉴定为三白草科蕺菜属植物HouttuyniacordataThunb．

2方法与结果

2．1鱼腥草多糖的提取与精制取鱼腥草干品200g，以95％乙醇回流脱脂3次，药渣置通风处晾干，加水10倍量、8倍量、8倍量，于90～100℃依次提取3，2，1h，过滤，合并滤液，浓缩至约200ml，加入等体积30％三氯乙酸溶液脱蛋白，4℃静置，离心，上清液用0．01mol／L的氢氧化钠调pH＝7，溶液减压浓缩，浓缩液对水透析，透析液减压浓缩至100ml，加入95％乙醇调含醇量为80％，静置，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮、无水乙醚依次洗涤，真空干燥，得除蛋白精制鱼腥草多糖。

2．2多糖含量测定方法的建立

2．2．1标准品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0．0964g，加水溶解并定容至100ml，再取1ml，定容至10ml的容量瓶中，即制得浓度为0．0964mg／ml的葡萄糖对照品贮备液。

2．2．2供试品溶液的制备称取鱼腥草50g，按正交设计表进行提取，得粗多糖。称取105℃干燥至恒重的粗多糖约30mg，精密称定，置于100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2．2．3标准曲线的绘制精密量取葡萄糖标准品溶液0．1，0．2，0．3，0．4，0．5，0．6，0．7ml，分别置10ml具塞试管中，加蒸馏水补充至1．0ml，摇匀，加5％苯酚溶液1ml，浓硫酸5ml，室温放置40min。另取1ml蒸馏水，加同量苯酚和浓硫酸，同法操作，作为空白对照。置UV－1800型分光光度计中，于490nm测定吸收度，以吸收度（Y）对葡萄糖含量（X）进行回归，得回归方程：Y＝9．1073X＋0．0102，相关系数r＝0．9998。结果表明葡萄糖在0．0193～0．0964mg／ml范围内呈良好的线性关系。

2．2．4换算因素的测定精密称取60℃干燥至恒重的鱼腥草多糖101．2mg，置100ml容量瓶中，加入少量蒸馏水溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取此液1ml，照标准曲线制备项下的方法测定吸收度，从回归方程中求出多糖供试液中葡萄糖的浓度。按下式计算换算因素：F＝W／（C×D）。F为换算因素；W为多糖重量（mg）；C为多糖稀释液中葡萄糖的浓度（mg／ml）；D为稀释因素。

2．2．5样品测定方法取各供试品溶液，按标准曲线项下方法操作，测定吸收值，从回归方程中求出供试液中葡萄糖的含量，按下式计算样品中多糖含量：多糖含量（％）＝C×D×F×100／W。C为供试液中葡萄糖的浓度（mg／ml）；D为供试液的稀释因素；F为换算因素，W为供试样品重量（mg）。

2．3正交实验法优化超声波提取鱼腥草多糖最佳工艺

2．3．1制定因素水平表根据文献报道［9］并结合实际，超声波提取多糖的影响因素有超声时间、料液比、醇沉浓度，为此选择3因素作为考察因素，并结合生产实际，每因素又选取3个水平，按L9（34）正交表安排实验，以多糖得率及含量作为衡量提取效率的双重客观指标，优选最佳工艺，为了提高统计分析的可靠性，每一条件下都作了重复实验（n＝3），测定结果取其平均值供统计分析用。因素水平安排见表1。结果见表2。

2．3．2加权法综合评价鱼腥草多糖提取工艺最佳提取条件要满足多糖得率高并且含量也高，因此采用加权评分法综合评估鱼腥草多糖提取条件。评分标准为：将各项指标除以该列最大值再乘以100，为其该项得分。通过这样处理，使多糖得率和多糖含量转化为0～100之间的数。根据多糖得率（x）和多糖含量（y）作用，而确定两者的权重系数分别为0．4和0．6，对两项指标进行加权求和，通过公式z＝0．4x＋0．6y，就得到综合评分（z）。加权评分结果及方差分析见表2～3。

表1正交因素水平（略）

表2正交实验及结果（略）

表3方差分析（略）

*表示差异显著，F0.10(2,2)=9.00，F0.05(2,2)=19.00

2．3．3结果分析正交实验方差分析表明，因素A（超声时间）对鱼腥草多糖的提取有显著影响，而因素B（料液比）、因素C（醇沉浓度）对鱼腥草多糖的提取无显著影响。由Rj得出影响因素大小顺序为A＞C＞B，由此得出最佳工艺为A3B1C3，即鱼腥草料液比1∶30，超声60min，醇沉浓度为90％。

2．3．4验证实验按照理论最佳工艺A3B1C3，进行重复实验，鱼腥草多糖得率及多糖含量分别为14．61％，12．22％，实验结果一致。

2．4不同提取方法的比较

2．4．1水煎煮提取鱼腥草多糖称取鱼腥草50g，加30倍体积的水，90℃提取3次，2h／次，过滤，90％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量。结果见表4。

2．4．2碱法提取鱼腥草多糖称取鱼腥草50g，加0．2mol／L30倍体积的氢氧化钠水溶液，65℃恒温水浴中浸提3h，过滤，滤液调pH为中性，90％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量。结果见表4。

2．4．3酸法提取鱼腥草多糖称取鱼腥草50g，加30倍体积的水，调pH＝3，60℃浸提3次，3h／次，过滤，滤液调pH为中性，90％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量。结果见表4。

2．4．4超声提取按该试验所得最佳工艺提取，即称取鱼腥草50g，加30倍体积的水，超声60min，过滤，90％乙醇醇沉得粗多糖，分别计算得率和多糖的含量，结果见表4。

表4不同提取方法比较（略）

3讨论

通过实验确定了超声波提取鱼腥草多糖最佳工艺为鱼腥草料液比1∶30，超声60min，醇沉浓度为90％。与水提、酸提、碱提方法进行比较，结果看出超声波提取多糖得率和含量略低于其它提取方法，但提取时间是酸提法的1／9，水提法的1／6，碱提法的1／3，大幅度降低成本；同时超声提取所得多糖颜色最浅，可降低下一步的脱色纯化的难度；另外超声提取全过程避免了高温加热，从而减少了酸碱对多糖结构的破坏，所用仪器简单，操作方便，因此也不失为一种好的提取方法。

鱼腥草目前主要是开发挥发油类成分的制剂如鱼腥草注射液等相关产品，而对于水溶性多糖以废弃物处理，本实验对鱼腥草多糖的提取工艺研究对于鱼腥草资源的合理充分利用具有重要的意义。

【参考文献】

［1］国家药典委员会．中国药典［S］．北京：化学工业出版社，2005：155．

［2］李爽，于庆海，金佩珂．鱼腥草的有效成分、药理作用及临床应用的研究进展［J］．沈阳药科大学学报，1997，14（2）：144．

［3］MengJ，DongXP，ZhaoZZ，etal．EstablishmentofGC－MSfingerprintoffreshHouttuyniacordata［J］．ChemPharmBull，2005，53（11）：1484．

［4］MengJ，DongXP，ZhaoZZ，etal．EstablishmentofHPLC－DAD－MSfingerprintoffreshHouttuyniacordata［J］．ChemPharmBull，2005，53（12）：1604．

［5］孟江，董小萍，赵中振，等．鲜鱼腥草的黄酮类化合物研究［J］．中国中药杂志，2006，31（15）：6．

［6］孟江，董小萍，赵中振，等．鲜鱼腥草的酚类化合物研究［J］．中国中药杂志，2007，33（9）：37.

［7］张建新．微波提取鱼腥草水溶性多糖清除自由基特性的研究［J］．食品科技，2006，8：115．

［8］余世春，徐金龙，汪海孙，等．苯酚－硫酸法测定小柴胡汤口服液多糖的含量［J］．中成药，1993，15：12．

［9］田春莲，廖博儒，陈建华，等．湖北地黄多糖超声波提取工艺条件及含量测定研究［J］．时珍国医国药，2007，18（1）：37．

【摘要】目的建立超声波提取鱼腥草多糖的最佳工艺。方法以多糖得率、多糖含量为指标成分，采用正交实验对鱼腥草多糖的超声提取工艺进行优选。结果最佳工艺为：鱼腥草料液比1∶30，超声60min，醇沉浓度为90％。多糖得率及含量分别为14．61％，12．22％。结论该方法简便，准确，灵敏度高，适合于鱼腥草多糖的提取。

【关键词】鱼腥草多糖超声提取正交实验