甘草总黄酮含量测定论文

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【摘要】目的选择适宜的对照品，建立能够准确测定甘草中总黄酮含量的方法。方法针对甘草苷、柚皮苷、芦丁3种对照品分别使用紫外分光光度法，通过全波长扫描，比较不同对照品和样品与显色前后的最大吸收波长，从而确定适合的对照品。结果甘草苷对照品和样品液经过碱处理后最大吸收波长分别为334，334.5nm且全波长扫描后得到峰形基本一致，而柚皮苷对照品经过相同处理后最大吸收波长在419.5nm，芦丁对照品和样品分别经过Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2显色后最大吸收波长在510nm和363nm。通过对3种方法的测定结果进行统计学分析，以甘草苷为对照品的测定结果分别与另外两种方法差异显著。结论选用甘草苷为对照品应用于紫外分光光度法测定甘草总黄酮成分准确度较高，是切实可行的含量测定方法。

【关键词】甘草黄酮紫外分光光度法

Abstract:ObjectiveToselecttheappropriatestandardfordeterminationofflavonoidsinGlycyrrhiza.MethodsTocomparethelargestabsorptionwavelengthbywavelengthscanningofultravioletspectrophotometry.ResultsStandardLiquiritinandsamplesprocessedbyalkalihadthelargestabsorptionatthe334nmand334.5nmwavelength,andstandardNaringinatthe419.5nmwavelength.ConclusionTodeterminecontentofflavonoidsinglycyrrhizawithultravioletspectrophotometrybystandardLiquiritinisapracticalmethodwithhigheraccuracy.

Keywords:Glycyrrhiza;Flavonoids;Ultravioletspectrophotometry

甘草中的黄酮类成分包括黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类和双黄酮类［1］化合物，其中以二氢黄酮类和查尔酮类含量较高［2］。二氢黄酮类包括：甘草苷(liquiritin)、甘草苷元(liquiritigenin)、新甘草苷(neoliquiritin)、甘草素（liquiritigenin）等，查尔酮类包括：异甘草苷(isoliquiritin)、异甘草素（isoliquiritigenin）、异甘草苷元(isoliquiritigenin)、新异甘草苷(neoisoliquiritin)等［3～7］。而其中比例较大的成分以甘草苷为主［8］。

甘草总黄酮的测定常用芦丁［9～10］、柚皮苷［11～13］为对照品通过紫外分光光度法进行测定，而《中国药典》中甘草项下没有规范总黄酮成分含量的测定方法［14］，导致甘草总黄酮成分有多种不同的测定方法。本实验研究通过对不同测定方法进行考察，比较不同对照品和样品采用相应方法显色后的最大吸收波长，对3种对照品相应测定结果分析，确定最适宜甘草总黄酮含量测定的对照品和测定方法。

1器材

1.1仪器HITACHIU-2000Spectrophotometer。

1.2样品甘草生药样品由北京中医药大学王文全教授提供和鉴定,全部为甘草GlycyrrhizauralensisFisch（样品按来源依次编号为1.杭锦旗1年生；2.杭锦旗2年生；3.杭锦旗3年生；4.杭锦旗4年生；5.杭锦旗5年生；6.新疆乌苏3年生；7.杭锦旗野生；8.杭锦旗野生横生茎；9.甘肃金塔野生；10.宁夏盐池野生；11.甘肃酒泉野生；除杭锦旗野生横生茎外其余10份样品均为根）。

1.3试剂供含量测定用甘草苷（编号：111610）、柚皮苷（编号：110722）：中国药品生物制品检定所；芦丁对照品由北京中医药大学马长华教授制备；氢氧化钾(AR)、甲醇(AR)、硝酸铝（AR）、亚硝酸钠（AR）、氢氧化钠（AR）。

2方法

2.1对照品溶液的制备精密称定甘草苷、柚皮苷、芦丁标准品适量,用甲醇溶解,分别定容于25，10，10ml容量瓶中,制得浓度为0.07504g·L-1的甘草苷对照品溶液、0.968g·L-1的柚皮苷对照品溶液和1.003g·L-1的芦丁对照品溶液。

2.2样品的提取取甘草粉末适量,精密称定,加甲醇50ml,称重,（250W,20kHz）超声提取80min,称重,补足损失重量,过滤,收集续滤液,即得。

2.3测定方法

2.3.1甘草苷为对照品的测定方法精确吸取提取液0.5ml,加入1ml甲醇,其中一份加入10%KOH溶液0.5ml显色,室温放置5min,用甲醇稀释至10ml，以相应溶剂为空白，在λ334nm处测定吸收度。

2.3.2柚皮苷为对照品的测定方法供试液制备同“2.3.1”项，在波长419nm处测定吸收度。

2.3.3芦丁为对照品的测定方法精确吸取提取液0.5ml，加3ml蒸馏水，5%亚硝酸钠溶液0.5ml放置6min，加10%硝酸铝溶液0.5ml，混匀后放置6min，加5%氢氧化钠2.5ml混匀，放置15min后蒸馏水定容至10ml。以相应溶剂为空白，在波长510nm处测定吸收度。

2.4方法学考察

2.4.1以甘草苷为对照品方法学考察甘草苷方法标准曲线的测定：精确吸取甘草苷对照品溶液0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5ml置6个10ml容量瓶中,按“2.3.1”项下操作。以吸收度A为纵坐标,对照品的浓度C(mg/ml)为横坐标,得线性回归方程:y=66.753x-0.0178,r=0.9999,线性范围为18.76～112.56μg。显色30min内稳定。

甘草苷方法重复性实验：取6份新疆乌苏3年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制备，按“2.3.1”项下方法测定。黄酮平均含量为3.33%，RSD=3.23%,（n=5）。

甘草苷方法加样回收率实验：取5份新疆乌苏3年生人工栽培甘草粉末按“2.2”项下制备后分别精密量取已知总黄酮含量的提取液0.5ml，加入一定量甘草苷对照品溶液，λ334nm处测定吸收度。计算回收率,结果平均为98.7%,RSD=2.0%,（n=5）。

2.4.2另外两种测定方法的方法

学考察柚皮苷标准曲线以吸收度A为纵坐标,对照品的质量m（mg）为横坐标,得线性回归方程y=0.0048x-0.0157，r=0.9993，线性范围48.4～290.4mg，重现性RSD=1.38%（n=5），加样回收率98.73%RSD=1.35%（n=5）；显色30min内稳定。芦丁标准曲线：以吸收度A为纵坐标,对照品的质量m（mg）为横坐标,得线性回归方程y=1.3163x-0.0063,r=0.9987，线性范围0.1003～0.6018mg，重现性RSD=0.97%（n=5），加样回收率101.35%RSD=3.57%（n=5）。显色30min内稳定。

3结果和讨论

3.1不同对照品吸收峰比较分析通过实验测得甘草提取液样品经KOH显色后的最大吸收波长在334.4nm（图1），甘草苷对照品KOH显色后于200～500nm波长处扫描,最大吸收波长在334nm左右（图2），二者相符。

柚皮苷经过KOH显色后于200～500nm波长处扫描，最大吸收283.5nm红移到419.5nm（见图3），与样品显色后最大吸收波长不一致。

样品通过Al2(NO3)3-NaOH-NaNO2方法显色后最大吸收波长在363nm处（见图4），芦丁对照品通过Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2方法显色后最大吸收波长在510nm左右，两者相距甚远。

3.2不同对照品方法实测结果比较分析对11份样品依“2.2”项下制备，分别依据甘草苷、柚皮苷和芦丁的显色方法在不同波长处进行测定，结果见表1。表13种方法总黄酮含量测定结果（略）

通过使用SPSS10.0对表3中数据进行多因素方差分析，3种方法测定结果方差分析F值17.845，P≈0.000说明3种方法测定结果有差异，两两比较结果见表2。表2不同方法测定结果间黄酮含量均数的两两比较（略）

按α=0.05水准，柚皮苷方法和芦丁方法测定的黄酮含量均数比较无统计学差异，而甘草苷方法分别与其他两种方法测定结果差异显著。柚皮苷和芦丁方法测定结果分别较甘草苷方法测定结果低29.6%和28.1%。

3.3超声提取时间考察在确定对照品等方法的基础上我们对样品提取时间进行了考察，分别对超声50，60，70，80，90，100min的样品进行测定，发现黄酮百分含量与时间关系如图6，随着时间的增加，黄酮百分含量有所提高，但达到80min后，升高趋势明显变缓，考虑到实验效率和成本，我们采用80min作为提取时间。

4讨论

在对照品的选择上,由于芦丁属于黄酮类化合物（结构为5、7、3''''、4''''-四羟基黄酮-3-芸香糖苷）,甘草中黄酮成分主要为二氢黄酮,其次为查尔酮,芦丁在结构上差异较大,因此不适合用于甘草总黄酮成分测定。柚皮苷（结构为5、7、4''''-三羟基二氢黄酮）虽然是二氢黄酮类化合物，但同甘草苷(结构为7-羟基二氢黄酮-4''''-葡萄糖苷)相比，除都具有7位羟基外，还有5位的游离羟基，且4''''位的羟基是游离的，未结合成苷，结构上的差异，导致与碱反应后最大吸收波长红移不一致，我们采用黄酮中含量最多的甘草苷为对照品，利用二氢黄酮与碱反应后生成查尔酮，由于带I吸收较弱，不灵敏，因此用带II最大吸收红移到330nm左右进行黄酮成分的含量测定。

在选定以甘草苷为对照品的基础上，我们进一步进行了显色方法的考察，尝试盐酸镁粉法进行测定，考察了镁粉用量、加热时间和温度对显色的影响，发现同样条件显色后甘草苷标准品和样品均在560nm左右有一吸收峰，然而样品在467nm处一吸收峰对其造成干扰（见图5）。

黄酮作为重要的药效组分在甘草中有着丰富的种类和较高的含量，如果不采用适宜的测定方法会使结果偏离真实值，从而影响我们对甘草质量客观真实的评价。

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