金钗石斛提取物抗白内障研究论文

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【摘要】【目的】探讨金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)总生物碱和粗多糖对白内障的抑制作用。【方法】采用溶剂法分离提取金钗石斛总生物碱和粗多糖;体外培养大鼠晶状体,加入H2O2与总生物碱(或粗多糖)共培养24h;分别在培养后6、12、18、24h共4个时段于解剖显微镜下观察并记录晶状体混浊度的改变;检测晶状体水溶性蛋白、谷胱甘肽(GSH)的含量及总超氧化物歧化酶(TSOD)和丙二醛(MDA)的活性。【结果】金钗石斛总生物碱和粗多糖均能减轻晶状体混浊度,并能显着升高晶状体水溶性蛋白、GSH含量及TSOD活性,降低MDA的活性(均P<0.05),其中石斛总生物碱高剂量组效果最佳。【结论】金钗石斛总生物碱和粗多糖在体外均有一定的抗白内障作用,其机制与拮抗晶状体的氧化损伤有关,而总生物碱的效果优于粗多糖。

【关键词】金钗石斛/药理学金钗石斛/化学白内障/中药疗法晶状体/病理学器官培养

白内障(cataract)是一种常见的致盲眼病,它是多种因素共同作用的结果,氧化损伤是其发病机制之一[1]。当前许多中药研究都是从提高晶状体抗氧化能力入手,利用抗氧化剂或抗氧化酶激活剂来消除或中和晶状体中的氧化产物,阻止或逆转晶状体变浑浊,从而抑制或延缓白内障的发生发展[2]。石斛是一种名贵中药材,抗白内障是其主治功效之一。已有研究证实,石斛水煎剂可通过改变晶状体相关酶的活性而对D半乳糖性白内障起到防治作用[3],石斛的乙酸乙酯提取物在体外还可抑制醛糖还原酶和过氧化脂质(LPO)的产生[4],这些研究在一定程度上揭示了石斛抗白内障的作用机理。然而,石斛化学成分复杂,其抗白内障的具体有效成分是什么,至今仍未见报道。本实验通过体外培养晶状体,对金钗石斛(DendrobiumnobileLindl.)的粗提物总生物碱(totalalkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白内障作用进行了探讨,现报道如下。

1材料和方法

1.1动物4~5周龄Wistar大鼠20只,体质量80~120g,雌雄不限,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:粤临证字2007A025。

1.2药材和试剂金钗石斛由贵州赤水信天石斛有限公司提供,经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定。DMEM低糖培养基(杭州吉诺生物医药技术有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS,福州迈新生物技术开发公司);体积分数30%过氧化氢(H2O2,浙江临安化工二厂);吡诺克辛钠滴眼液(武汉天天明药业有限责任公司,批号:070102);Bradford蛋白质定量试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品;其他试剂均为国产分析纯。

试剂配制如下。改良碘化铋钾试剂:甲液:0.85g次硝酸铋溶于10mL冰醋酸,加水40mL;乙液:8g碘化钾溶于20mL水中;将甲液与乙液等量混合后,取1mL与2mL醋酸混合,供生物碱的显色用。Molish试剂:甲液:α萘酚1g,加体积分数75%乙醇至10mL;乙液:浓硫酸;供多糖的检测用。

1.3仪器E52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHZDIII型循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂);BS110S型电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);HI98128型pH计(北京HANNA);SWCJIF型超净台(苏州净化设备厂);Galaxys型CO2培养箱(美国RSBiotech);STPT型解剖显微镜(日本OLYMPUS);5810R型低温高速离心机(德国Eppendorf);7200型分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)。

1.4金钗石斛总生物碱和粗多糖的分离提取及检识金钗石斛总生物碱和粗多糖的提取方法参照文献[5-6]并略加改进:干燥金钗石斛切碎打成粗粉,加入体积分数为95%乙醇85℃回流提取(4h/次×3次),合并提取液,减压回收乙醇后得到石斛浸膏,加1moL/LHCL调节浸膏的pH为3,氯仿萃取3遍后,弃氯仿层,加浓氨水调母液pH=11,再经氯仿萃取3遍,将氯仿层合并,减压浓缩,挥干氯仿后即得到总生物碱。将醇提后的药渣晒干后加入20倍体积的水,100℃回流提取(2.5h/次×4次),合并提取液,减压浓缩至一定容积后,加入体积分数95%乙醇,直至醇浓度为70%,置于冰箱内,隔夜取出沉淀用无水乙醇和丙酮各洗涤3遍,再经Sevag法除蛋白处理,冷冻干燥,得到粗多糖。总生物碱的检识参照文献[7]:取少量分离所得的总生物碱于试管内,加入蒸馏水和10μL二甲基亚砜(DMSO)将其充分溶解,滴在硅胶板上,喷雾改良碘化铋钾试剂后,可见硅胶板上滴了提取物溶液的点显现出非常明显的桔红色斑点,由此证明提取物为生物碱。粗多糖的检识参照文献[7]:取多糖水溶液1mL加入Molish试剂3滴,摇匀,倾斜试管,沿试管壁缓慢滴加1mL浓硫酸,静置,可见在试液与浓硫酸交界面产生非常明显的紫色环,证明提取物为多糖。

1.5药物配制用PBS分别将总生物碱和粗多糖配制成浓度为50mg/mL的溶液(生物碱加10μLDMSO助溶),0.22μm微孔滤膜过滤灭菌处理后-20℃保存待用。

1.6晶状体的培养及分组参照文献[8]的方法并略加改进:颈椎脱臼处死大鼠,用眼科剪镊迅速摘取双眼眼球,以含800U/mL青霉素、800μg/mL链霉素的冷PBS液漂洗眼球后,投入含相同浓度双抗液的PBS液中浸泡,转入超净台。约10min后将大鼠眼球转移至含500U/mL青霉素、500μg/mL链霉素的DMEM培养液中,小心从眼球后极部剪开巩膜,取出晶状体,去除晶状体表面的虹膜和玻璃体,晶状体经PBS液漂洗2遍后,再用DMEM液漂洗1遍,然后再放入已预热的24孔组织培养板中培养,每孔含1mLDMEM培养基(含体积分数20%胎牛血清、100μ/mL青霉素、100μg/mL链霉素),预培养5h(37.0℃、体积分数5%CO2)后,剔除受损伤或已混浊的晶状体。将35只未受损伤、透明的晶状体按照随机原则分7个组培养,每组5只:正常对照组(DMEM培养基+100μL胎牛血清),模型组(正常对照组培养基+2mmol/LH2O2),生物碱高、低剂量组(正常对照组培养基中各加入2mmol/L的H2O2,同时分别添加4、2mg/mL生物碱),多糖高、低剂量组(在正常组培养基中各加入2mmol/L的H2O2,同时分别添加4、2mg/mL粗多糖),阳性对照组(正常对照组培养基+2mmoL/L的H2O2+100μL吡诺克辛钠滴眼液)。上述各组培养基均含100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素。

1.7观察并照相记录晶状体混浊度加药培养后,每6h更换1次培养液以保持H2O2浓度不变。同时观察并记录各组晶状体混浊度。离体培养晶状体混浊度的分级方法参照文献[9]:在黑色背景下设计1mm×1mm的黑色方格图,将被检晶状体置于"+"字交叉的黑色线条之上,在解剖显微镜下观察晶状体,按透过晶状体所能看到的线条清晰度进行分级。"-"表示线条清晰可见,为完全透明;晶状体"+"混浊:线条模糊,但轮廓尚可辨;"++"混浊:线条轮廓不清,仅中央部隐约可见;"+++"混浊:线条完全不见,晶状体全部混浊。最后以各组晶状体混浊度,即"+"出现量的多少进行统计学处理。培养后24h,给各只晶状体拍照。

1.8晶状体水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性检测晶状体拍照后,用冷PBS液洗涤2遍,尽量洗净培养液,再用滤纸吸干水分,称质量。按质量与体积比为1∶10的量加入冷PBS液,在冰浴上充分匀浆后倒入2mL离心管中,4℃、12000r/min离心20min,取上清即为晶状体水溶性蛋白,采用Bradford法检测定蛋白含量。取剩余上清,分别采用二硫代二硝基苯甲酸法检测GSH含量,采用黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物歧化酶(TSOD)活性,采用硫代巴比妥酸(thibabituricacid,TBA)法检测MDA活性,以上操作方法均严格按照试剂盒说明书进行。

1.9统计学方法应用统计软件SPSS11.5对所有数据进行统计分析。

2结果

2.1各组药物对晶状体混浊度的影响晶状体分组培养后6h,模型组晶状体均出现"+"度浑浊,其他各组均透明;继续培养6h,可见正常对照组晶状体均保持透明,模型组晶状体为"++"~"+++"度混浊,其他各组晶状体混浊度在"+"~"++"度不等;培养后24h,正常对照组晶状体均保持透明,模型组晶状体均为"+++"度混浊,肉眼观为乳白色,且晶状体体积明显缩小,其他各组晶状体混浊度表现为"+"~"+++"不等。各个药物添加组中,阳性对照组、生物碱高剂量组晶状体混浊度较模型组显着减轻(均P<0.05);生物碱高、低剂量组及粗多糖高、低剂量组晶状体混浊度与阳性对照组比较均无显着性差异(P>0.05)。将各组晶状体混浊度与过氧化氢损伤的时间进行相关性分析,其中生物碱高剂量组差异有显着性意义(P<0.01),其他各组差异也均有显着性意义(P<0.05),由此可见,随H2O2作用时间的延长,晶状体混浊度逐渐加重。结果见表1及图1。

表1不同时段各组晶状体混浊度量化比较(略)

Table1Comparisonofthelensopacityratioatdifferentstages

统计方法:t检验;①P<0.05,与正常对照组比较;②P<0.05,与模型组比较

a.正常对照组b.模型组c.阳性对照组d.生物碱高剂量组e.生物碱低剂量组f.多糖高剂量组g.多糖低剂量组

图1培养24h后各组晶状体混浊度比较(×25)(略)

Figure1Thelensopacityindifferentgroupsafterculturingfor24h(×25)

2.2各组药物对晶状体水溶性蛋白、GSH含量及MDA、TSOD活性的影响由表2可见,模型组与正常对照组比较,水溶性蛋白含量、GSH含量、TSOD活性均显着降低,MDA活性显着升高(均P<0.05),而阳性对照组、生物碱组、粗多糖组可显着升高水溶性蛋白、GSH含量以及TSOD活性,降低MDA活性,各给药组与模型组比较,差异均有显着性意义(P<0.05)。生物碱高剂量组水溶性蛋白含量显着高于阳性对照组(P<0.05),GSH含量除多糖低剂量组显着低于阳性对照组外(P<0.05),其他各实验组与阳性对照组比较均无显着性差异(P>0.05);TSOD活性除生物碱低

表2各组晶状体水溶性蛋白、GSH含量及MDA、TSOD活性变化比较(略)

Table2Comparisonofthecontentsofwatersolubleprotein,GSH,andtheactivityofMDA,TSODindifferentgroups

统计方法:t检验;①P<0.05,与正常对照组比较;②P<0.05,与模型组比较;③P<0.05,与阳性对照组比较剂量组和多糖低剂量组显着低于阳性对照组外(P<0.05),其他各组与阳性对照组比较均无显着性差异(P>0.05);MDA活性除生物碱高剂量组显着低于阳性对照组(P<0.05)外,其他各组与阳性对照组比较均无显着性差异(P>0.05)。

3讨论

晶状体的氧化损伤是目前常用的白内障研究模型,而H2O2是很好的氧化损伤诱导剂。体内抗氧化系统功能下降或氧化作用增强均可导致眼组织的损伤,诱发或促进白内障的形成[10-11]。而活性氧簇,如H2O2、超氧阴离子、单态氧、氢氧根等可以引起很多生物学变化,最终使晶状体的水不溶性蛋白增加而形成白内障[12]。GSH是一种抗氧化酶,在晶状体中含量较高,对晶状体起着多方面的重要作用[13]。SOD和MDA常常相互配合用以反映组织细胞氧化/抗氧化系统功能的平衡。此外,氧化损伤等因素致晶状体蛋白质分子构型发生改变,造成可溶性蛋白质含量的减少和不可溶性蛋白质含量的增高[14],而不溶性蛋白质聚集,即导致晶状体光散射作用增加,即失去透明性。本研究采用体外构建氧化损伤白内障模型的方法,对金钗石斛总生物碱和粗多糖的抗白内障作用进行探讨。结果显示,模型组可溶性蛋白含量显着低于正常对照组,而各用药组可显着缓解可溶性蛋白的减少,生物碱高剂量组尤其明显;同时,金钗石斛的提取物总生物碱和粗多糖均可提高晶状体GSH含量及SOD活性,同时降低MDA活性,即通过提高晶状体抗氧化能力而达到抑制白内障的作用。

石斛具有抗白内障的作用早已被证实,但其抗白内障的确切有效成分至今仍未见报道。本实验证实,金钗石斛的两种药效部位(总生物碱和粗多糖)在体外可通过减轻晶状体的氧化损伤而抑制白内障的进程,且总生物碱的效果优于粗多糖。然而,金钗石斛化学成分复杂,据文献报道,其总生物碱含量达0.4%~0.6%,种类有30多种,多糖含量也高达4%,并以各种不同的形式存在[15],因此,下一步研究可从这两种粗提物入手,进一步挖掘金钗石斛抗白内障的确切有效成分,并阐明其抗氧化的具体反应过程,这对于抗白内障的药物研究以及金钗石斛药用价值的开发都有着重要的意义。

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