仙鱼汤对小鼠肺癌研究论文

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【摘要】【目的】探讨具有健脾清肺、化痰祛瘀作用的中药复方仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用及其相关的分子机制。【方法】将50只Lewis肺癌荷瘤小鼠分为仙鱼汤高、中、低剂量组(剂量分别为1.747、0.874、0.437g·kg-1·d-1),环磷酰胺(CTX)组(剂量为20mg·kg-1·d-1),荷瘤模型组;计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率;制备单细胞悬液,采用流式细胞仪检测各组小鼠Lewis肺癌细胞周期、细胞凋亡率;采用免疫组化法检测各组Lewis肺癌小鼠的bcl2基因的表达。【结果】仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组,肿瘤细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05或P<0.01),仙鱼汤各组随着药物剂量的增大,抑瘤率和肿瘤细胞凋亡率逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于S期的细胞比例均低于模型组(P<0.05或P<0.01),呈现明显的G0/G1期阻滞现象。仙鱼汤各剂量组bcl2染色强度指数显着低于模型组(P<0.01)。【结论】仙鱼汤具有抑制小鼠Lewis肺癌生长的作用,其机理可能与通过降低bcl2表达从而促进肿瘤细胞凋亡有关。

【关键词】仙鱼汤/药理学肺肿瘤/中药疗法细胞凋亡基因表达调控细胞培养

肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一,中医药在肺癌的治疗中发挥着越来越重要的作用。仙鱼汤是治疗肺癌的经验方,具有健脾清肺、化痰祛瘀之功效,多年的临床应用已证实其具有较好的临床疗效[1-2]。本研究通过动物实验,进一步研究了仙鱼汤对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用,并从诱导肿瘤细胞凋亡及调控凋亡相关基因的角度探讨其作用机理。现报道如下。

1材料与方法

1.1动物C57BL/6J小鼠,雌雄各半,体质量18~22g,SPF级,由广州中医药大学实验动物中心提供(合格证号:0020535)。

1.2瘤株小鼠Lewis肺癌细胞株由中国医科大学肿瘤研究所提供,广州中医药大学第一附属医院中医肿瘤研究所长期移植传代。

1.3药物与制备仙鱼汤组成:仙鹤草15g,鱼腥草30g,猫爪草30g,山海螺30g,党参15g,三七片10g,山慈菇10g,浙贝母15g,守宫5g,天冬15g,黄芪30g,炙甘草5g。由广州中医药大学新药研究中心制备,按照传统煎煮法煎煮,低、中、高剂量组药物浓度根据人与动物体表面积与计量换算法计算[3],低剂量组1.092g/mL,中剂量组2.184g/mL,高剂量组4.368g/mL,分别相当于临床等效剂量的1、2、4倍。制备后于4℃冰箱中贮存备用。环磷酰胺(CTX)注射用粉针剂为山西普德药业有限公司产品(批号:20060206),200mg/支,临用前用生理盐水溶解,稀释浓度为2mg/mL,根据CTX的半数致死量(LD50)为472mg/kg,注射用量为LD50的1/3~1/5,故小鼠给药剂量设为20mg·kg-1·d-1。

1.4主要试剂与仪器碘化丙啶(PI)染液为晶美生物工程有限公司产品;bcl2兔多克隆抗体、即用型过氧化物酶免疫组织化学染色(SABC)试剂盒(SA1022)均为博士德生物工程有限公司产品;RPMI1640培养基为Gibco公司产品;二甲苯、乙醇,均为市售分析纯;超净工作台(苏净集团安泰公司);冷冻桌面离心机(Eppendorf5810RCentrifuge);解剖显微镜(北京电子光学设备厂);37℃电热恒温水浴箱(上海恒丰仪器仪表有限公司);ALTRA型流式细胞仪(美国Beckmancoulter公司);CSⅣ型烤片机(孝感市电子仪器厂);亿鸣200病理图像分析系统(中国亿鸣)。

1.5Lewis肺癌荷瘤小鼠模型复制于液氮罐中取出Lewis肺癌细胞株1支,置于37℃电热恒温水浴箱内,轻轻摇动令其尽快融化。取出冻存管,用酒精消毒后开启,用吸管吸出细胞悬液,注入离心管并滴加体积分数10%小牛血清RPMI1640培养基,常规离心,制成瘤细胞混悬液,台盼蓝计数约为1×107/mL瘤细胞。消毒小鼠右前腋,取0.2mL(约1×106~2×106个瘤细胞)接种于皮下。传代3次。在无菌条件下剥离Lewis肺癌荷瘤鼠皮下瘤块,选取生长良好的瘤组织,剪碎、称质量,用细胞匀浆器制成匀浆,按体积比1:3加生理盐水制成瘤细胞混悬液,接种于C57BL/6J小鼠右前肢腋窝皮下,每只0.2mL(约1×106~2×106个瘤细胞)。

1.6分组及给药接种24h后随机分为5组:仙鱼汤高剂量组(剂量为1.747g/kg)、仙鱼汤中剂量组(剂量为0.874g/kg)、仙鱼汤低剂量组(剂量为0.437g/kg)、CTX阳性对照组(剂量为20mg/kg)、荷瘤模型组。中药各组均予以0.4mL中药灌胃,CTX组予以0.2mL腹腔注射,荷瘤模型组予以0.4mL生理盐水灌胃,均每日1次,给药14d。

1.7观察指标及检测方法

1.7.1小鼠生活状态观察实验过程中观察小鼠的饮食、毛发、活动、精神状态等情况。

1.7.2抑瘤率末次给药后24h,Lewis荷瘤小鼠颈椎脱臼处死,用眼科剪分离剥取肿瘤,电子天平称质量,计算各组小鼠平均瘤体质量及抑瘤率[4]:p抑瘤=(1-m实验组/m模型组)×100%。

1.7.3细胞周期分析及细胞凋亡检测取小块瘤组织,加入生理盐水洗净血迹后倒掉,再加入1mL生理盐水,用眼科剪剪碎组织,吸管轻轻吹打,过300目筛,收集单细胞悬液于流式专用管,加入2mL中性磷酸盐缓冲溶液(PBS),1300r/min离心5min洗涤2次,调整细胞计数约1×106/mL,加入体积分数70%冰乙醇2mL吹打后封口固定,保存于4℃冰箱24h。将固定的单细胞悬液离心,去固定液,加入PBS重新悬浮,洗涤2次,300目筛网过滤1次,加入1mLPI染液(终浓度100mg/L),4℃避光染色30min,流式细胞仪检测,收集50000个细胞,应用multicycle软件分析凋亡率[5]。

1.7.4病理检查肿瘤组织经体积

分数10%福尔马林固定24h后常规石蜡包埋,4μm厚连续切片,苏木素-伊红(HE)染色,光镜观察肿瘤生长、肿瘤坏死、间质反应和肿瘤及肿瘤周围组织炎症细胞浸润情况并摄片。

1.7.5bcl2阳性表达检测采用免疫组化法。常规石蜡包埋后,4μm厚连续切片,行SABC法免疫组织化学染色,用PBS液代替一抗做阴性对照。光学显微镜下观察,bcl2蛋白染色细胞浆呈棕黄色为阳性。在高倍镜视野(400)下随机计数5个视野。计算出各组的染色强度指数(stainingintensityindex,pSII)。pSII=(pA强度瘤细胞×0)+(pB强度瘤细胞×1)+(pC强度瘤细胞×2)+(pD强度瘤细胞×3)。其中A强度代表细胞浆无特异性染色;B强度代表细胞浆呈特异性浅棕黄色,染色较浅;C强度代表细胞浆呈特异性棕黄色;D强度代表细胞浆呈特异性深棕色,染色较深。染色强度指数(pSII)的范围在0~3[6]。

1.8统计学分析采用SPSS11.5统计软件处理。

2结果

2.1一般状况的观察实验结束后,模型组、CTX组小鼠表现为身体瘦小,活动少,喜聚群,毛发缺少光泽;CTX组小鼠于实验5~7d开始出现脱毛,进食减少;仙鱼汤高、中、低剂量组小鼠脱毛现象少于CTX组及模型组,活动力优于CTX组及模型组。

2.2各组抑瘤率比较表1结果表明,仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组瘤体质量均低于模型组(P<0.05或P<0.01)。各仙鱼汤组随着药物剂量的增大,瘤体质量逐渐减轻,抑瘤率逐渐增高。

表1各组Lewis肺癌小鼠的瘤体质量及抑瘤率比较(略)

Table1Comparisonoftumormassweightandtumorinhibitoryrateindifferentgroups

统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,与模型组比较

2.3各组细胞凋亡率及细胞周期分析仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组小鼠Lewis肺癌细胞凋亡率均高于模型组(P<0.05或P<0.01),各仙鱼汤组随着剂量的增大,凋亡率亦逐渐增加。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于G0/G1期细胞的比例均高于模型组,其中仙鱼汤高剂量组、CTX组与模型组比较,差异有显着性意义(P<0.01)。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于S期细胞的比例均显着性低于模型组(P<0.05或P<0.01),呈现明显的G0/G1期阻滞现象。仙鱼汤高、中、低剂量组及CTX组处于G2/M期细胞的比例与模型组比较,差异无显着性意义(P>0.05)。结果见表2、图1。

2.4光镜观察模型组癌细胞大小和形态很不一致,可见瘤巨细胞;癌细胞核体积增大,细胞核和细胞浆比例增大,核的大小、形状、染色不一,可见巨核、多核,核染色深,核染色质呈粗颗粒状,分布不均匀;核仁肥大,数目增多,核分裂相增多,可见不对称性、多极性及顿挫性等病理性核分裂相,间质内淋巴细胞少见(图2-a)。CTX组可见大片坏死,间质见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润,纤维组织反应性增生(图2-b)。仙鱼汤各剂量组可见癌巢内坏死面积增大,间质可见淋巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体(图2-c、d、e)。

2.5各组bcl2染色强度指数凋亡相关基因bcl2的阳性产物主要位于细胞浆,可见大量的细胞浆棕黄色颗粒染色。仙鱼汤各剂量组bcl2的染色强度指数均显着低于模型组(P<0.01),并呈剂量依赖性,而CTX组与模型组比较差异无显着性意义(P>0.05)。结果见表3、图3。

表2各组小鼠Lewis肺癌组织的细胞凋亡率及细胞周期分析(略)

Table2Comparisonofcellapoptosisratioandcellcycleanalysisindifferentgroups

统计方法:单因素方差分析;①P<0.05,②P<0.01,与模型组比较

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图1各组凋亡率检测流式细胞图谱比较(略)

Figure1Resultsofcellapoptosisratiodetectedbyflowcytometerindifferentgroups

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图2各组肿瘤组织形态比较(HE染色,×400)(略)

Figure2Morphologicalchangesoftumorcellsunderlightmicroscopeindifferentgroups(HEstaining,×400)

a.模型组b.CTX组c.仙鱼汤低剂量组d.仙鱼汤中剂量组e.仙鱼汤高剂量组

图3各组bcl2阳性表达比较(免疫组化,×400)(略)

Figure3Positiveexpressionofbcl2indifferentgroupsdetectedbyimmunohistochemicalmethod

表3各组bcl2染色强度指数比较(略)

Table3Comparisonofstainingintensityindexofbcl2indifferentgroups

统计方法:单因素方差分析;①P<0.01,与模型组比较

3讨论

多数学者认为,肺癌发生发展的中医病机可以用"痰、瘀、虚"3个字高度概括。其中正虚是肺癌发生的基础,《医宗必读》云:"积之成者,正气不足,而后邪气踞之。"正虚又以脾虚为主,"脾为生痰之源,肺为贮痰之器"。正是脾虚导致痰浊内生,进一步血停成瘀,瘀血内生,痰瘀内阻,蕴积肺部,日久而发为本病。

广州中医药大学陈锐深教授从肺癌病因病机出发,以健脾清肺、化痰祛瘀为治疗

大法,自拟了治疗肺癌的经验方"仙鱼汤"。方中君药为党参,具有补中益气、健脾益肺、生津养血的功效,为补益肺脾气之要药。黄芪配合党参,以补肺脾之气;浙贝母清热化痰、开郁散结;猫爪草散结消肿;三七片化瘀散结止痛,共为臣药。仙鹤草收敛止血、解毒抗癌;鱼腥草清热解毒、消痈排脓;天冬养阴清肺生津;山海螺解毒消肿、排脓祛痰;山慈菇清热解毒、化痰消肿散结;守宫散结止痛,共为佐药。炙甘草调和诸药,为使药。综合全方,扶正祛邪,攻补兼施,使祛邪而不伤正,共奏健脾清肺、化痰祛瘀之功效。

肿瘤的发生和发展不仅与肿瘤细胞的增殖、分化异常有关,而且与细胞凋亡的调控失常有关。人类细胞的凋亡机制十分复杂,目前已鉴定出了构成凋亡途径的多种成分,揭示出凋亡是受多种基因调控的,例如p53、p16、cmyc、bcl2、bax等相关基因均参与了细胞凋亡的调控[7]。bcl2是一种凋亡相关基因,被激活的bcl2基因的主要作用是抑制细胞凋亡,下调bcl2基因的表达,对肿瘤细胞有显着的生长抑制作用。bcl2可能通过阻断凋亡的公共信号传递通路(如抑制线粒体释放细胞色素C)达到抑制或阻断多种细胞及细胞系的细胞凋亡过程。随着该基因蛋白产物的过度表达,使得细胞增殖与凋亡的平衡发生紊乱,从而阻断细胞凋亡的最后共同通道,从而抑制细胞凋亡,导致癌变[8-11]。

本研究通过动物移植性肿瘤实验法探讨仙鱼汤对Lewis肺癌生长及肿瘤细胞凋亡的作用。结果表明,仙鱼汤具有一定的抗肿瘤作用,而且其抑瘤作用随着剂量的增加而增强。从HE染色的病理切片中发现,不同剂量仙鱼汤组可见癌巢内坏死面积增大,间质可见较多的淋巴细胞等炎细胞浸润,可见较多的细胞凋亡小体。进一步采用流式细胞仪检测凋亡率,结果表明仙鱼汤具有促进小鼠Lewis肺癌细胞凋亡的作用,并且随着剂量的增加作用也逐渐增强。仙鱼汤各剂量组处于G0/G1期细胞的比例均高于模型组,处于S期细胞的比例均低于模型组,呈现明显的G0/G1期阻滞现象,提示仙鱼汤可能使G1期细胞不能通过细胞周期检测点进入S期,从而发生G0/G1期阻滞,阻断DNA复制,干扰肿瘤细胞周期正常进行,以起到抑制肿瘤的作用。免疫组化检测结果显示,仙鱼汤各剂量组bcl2蛋白表达均显着低于模型组,并随着仙鱼汤剂量的加大,肿瘤组织bcl2的染色强度指数也逐渐降低。本研究实验结果提示仙鱼汤可能通过降低bcl2表达的途径促进肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用,对临床用药具有一定的指导意义。

【参考文献】

[1]李穗晖,陈锐深,吴玉生,等.仙鱼汤治疗中晚期原发性支气管肺癌40例疗效观察[J].新中医,2006,38(9):26.

[2]王坤,王俊.中医药治疗肺癌90例临床观察[J].黑龙江中医药,1994(2):12.

[3]马超英.实验中医学基础[M].北京:中国协和医科大学出版社,2000:279.

[4]陈奇.中药药效研究思路与方法[M].北京:人民卫生出版社,2005:1001.

[5]LiHuschtschaWA,BartuierCE,AndersonR,etal.Characteristicsofcancercelldeathafterexposuretocytotoxicdrugsinvivo[J].BrJCancer,1996,73:54.

[6]同济医科大学病理教研室,中山医科大学病理教研室.外科病理学[M].武汉:湖北科学技术出版社,1999:505.

[7]RomWN,HayJY,LeeTC,etal.Molecularandgeneticaspectsoflungcancer[J].AmJRespirCritCareMed,2000,161:1355.

[8]HishiiM,KurnickJT,RamirezMontagutT,etal.Studiesofthemechanismofcytolysisbytumorinfiltratinglymphocytes[J].ClinExpImmunol,1999,116(3):388.

[9]杨烔,吴小军,丁续红,等.肺癌组织中bcl2和bax的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系[J].武汉大学学报(医学版),2001,22(2):120.

[10]温雪萍,程西安,王有恒,等.Bcl2蛋白在肺癌组织中的表达及其意义[J].西安医科大学学报,2001,22(1):41.

[11]王得坤,郑俊猛,姜海明,等.bcl2基因表达与肺癌细胞凋亡的关系[J].癌症,2001,20(2):168.