土霉素片微生物验证论文

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【论文关键词】土霉素片;微生物限度检查法

【论文摘要】目的:建立土霉素片的微生物限度检查方法。方法:采用薄膜过滤法对土霉素片处理后,分别进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证。结果:金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。结论:土霉素片采用薄膜过滤法检查微生物限度方法成立。

TerramycinpiecemicroorganisminspectionmethodconfirmationWangYanningGuoLingbo

【Abstract】Objective:Establishmentterramycinpiecemicroorganismlimitinspectionmethod.Method:Usesthethinfilmtofilterthelawafterterramycinpieceprocessing,separatelycarriesonthebacterium,themoldandthesaccharomycetescountsthemethodconfirmation.Result:Thegoldenyellowstaphylococcusandthewhiterosaryfungusreturns-ratioisbiggerthan70%.Conclusion:Theterramycinpieceusesthethinfilmtofilterthelawinspectionmicroorganismlimitmethodtobetenable.

【Keywords】Terramycinpiece;Microorganismlimitinspectionmethod

土霉素是四环素类抗生素,能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位结合,抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成,对细菌有广谱抑菌作用。因此其微生物限度检查不能用平皿法,而应采用薄膜过滤法消除其抑菌作用后再检查。

1材料

1.1仪器:HWS-250型恒温恒湿箱(天津苏瑞科技开发有限公司),集菌仪(杭州泰林生物技术设备有限公司),薄膜(孔径0.22um),康氏振荡器。

1.2试剂:玫瑰红钠琼脂培养基,营养琼脂培养基,胆盐乳糖增菌培养基,MUG培养基,甘露醇氯化钠琼脂培养基等,均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3菌种:阳性对照菌:金黄色葡萄球菌(验证细菌)、白色念珠菌(验证酵母菌、霉菌);阴性对照:金黄色葡萄球菌(验证大肠埃希菌)。所用菌种均由中国药品生物制品检定所提供;稀释剂及冲洗剂为pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。

1.4样品:土霉素片[0.25g(25万单位)],厂家为河南华利药业有限责任公司,批号为07070601。

2方法与结果

2.1细菌、霉菌、酵母菌检查方法验证。

2.1.1细菌检测方法验证。

2.1.1.1试验组:取供试品10g,加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,于康氏振荡器上振摇10分钟,使片分散,500转、分离心后,分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中,薄膜过滤,用冲洗液冲洗2次,每次100ml,第3次冲洗液中加入金黄色葡萄球菌菌悬液0.5ml,薄膜过滤,取出滤膜,面朝上贴于营养琼脂平皿上,35℃培养48小时,计数。

2.1.1.2菌液组:取金黄色葡萄球菌菌悬液0.5ml,直接接种于营养琼脂平皿上,35℃培养48小时,计数。

2.1.1.3供试品对照组:取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中,薄膜过滤,用冲洗液冲洗3次,每次100ml,取出滤膜,面朝上贴于营养琼脂平皿上,35℃培养48小时,计数。

2.1.1.4稀释剂对照组:取稀释液10ml,薄膜过滤,用冲洗液冲洗2次,每次100ml,第3次冲洗液中加入0.5ml金黄色葡萄球菌菌悬液,薄膜过滤,取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂平皿上,35℃培养48小时,计数。

2.1.1.5上述试验连续做三次,结果如下:

金黄色葡萄球菌计数后平均值:

稀释剂对照组菌数:第一次47个,第二次53个,第三次49个;

菌液组菌数:第一次58个,第二次64个,第三次60个;

试验组菌数:第一次45个,第二次54个,第三次46个;

供试品对照组菌数:第一次0个,第二次0个,第三次0个。

2.1.1.6计算金黄色葡萄球菌回收率。

2.1.1.6.1稀释剂对照组的回收率:(稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数)×100%

第一次:47/58×100%=81.0%

第二次:53/64×100%=82.8%

第三次:49/60×100%=81.7%

2.1.1.6.2试验组的回收率:

[(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%

第一次:(45-0)/58×100%=77.6%

第二次:(54-0)/64×100%=84.4%

第三次:(46-0)/60×100%=76.7%

2.1.2霉菌、酵母菌检查方法验证。

2.1.2.1试验组:取供试品10g,加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,于康氏振荡器上振摇10分钟,使片分散,500转、分离心后,分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中,薄膜过滤,用冲洗液冲洗2次,每次100ml,第3次冲洗液中加入白色念珠菌菌悬液0.5ml,薄膜过滤,取出滤膜,面朝上贴于营养琼脂平皿上,23℃培养72小时,计数。

2.1.2.2菌液组:取白色念珠菌菌悬液0.5ml,直接接种于营养琼脂平皿上,23℃培养72小时,计数。

2.1.2.3供试品对照组:取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中,薄膜过滤,用冲洗液冲洗3次,每次100ml,取出滤膜,面朝上贴于营养琼脂平皿上,23℃培养72小时,计数。

2.1.2.4稀释剂对照组:取稀释液10ml,薄膜过滤,用冲洗液冲洗2次,每次100ml,第三次冲洗液中加入0.5ml白色念珠菌菌悬液,薄膜过滤,取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂平皿上,23℃培养72小时,计数。

2.1.2.5上述试验连续做三次,结果如下:

白色念珠菌计数后平均值:

稀释剂对照组菌数:第一次56个,第二次60个,第三次53个;

菌液组菌数:第一次45个,第二次47个,第三次42个;

试验组菌数:第一次43个,第二次45个,第三次44个;

供试品对照组菌数:第一次0个,第二次0个,第三次0个。

2.1.2.6计算白色念珠菌的回收率。

2.1.2.6.1稀释剂对照组的回收率:

(稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数)×100%

第一次:45/56×100%=80.4%

第二次:47/60×100%=78.3%

第三次:42/53×100%=78.2%

2.1.2.6.2试验组的回收率:

[(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%

第一次:(43-0)/56×100%=76.8%

第二次:(45-0)/60×100%=75.0%

第三次:(44-0)/53×100%=83.0%

2.2大肠埃希菌检测方法验证。

2.2.1试验组:取供试品10g,加入pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,于康氏振荡器上振摇10分钟,使片分散,500转/分离心后,分离上清液作为供试液。取上述供试液10ml,加入100ml稀释剂中,薄膜过滤,用冲洗液冲洗2次,每次100ml,第三次冲洗液中加入大肠埃希菌菌悬液0.2ml,薄膜过滤,取出滤膜,放入100ml胆盐乳糖培养基中,35℃培养24小时,取0.2ml上述培养物加入5mlMUG培养基中,24小时后,加靛基质试液5滴,液面呈现玫瑰红环。

2.2.2阴性菌对照组:照上述方法操作,第三次冲洗时冲洗液中加入2ml金黄色葡萄球菌菌液,薄膜过滤,取出滤膜加入100ml胆盐乳糖培养基中,于35℃培养24小时,再取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,于35℃培养24小时,未发现有金黄色葡萄球菌典型菌落。

3讨论

3.1在细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证三次平行试验中,稀释剂对照菌回收率均不低于70%,试验组的菌回收率均不低于70%,照薄膜过滤法可进行土霉素片的细菌、霉菌及酵母菌的检查。

3.2通过大肠埃希菌检测方法验证,阴性对照组未检出金黄色葡萄球菌,试验组检出大肠埃希菌,按薄膜过滤法可进行土霉素片的大肠埃希菌检查。