大鼠移植肝保护管理论文

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【摘要】目的探讨川芎嗪（TMP）对大鼠移植肝的保护作用。方法参照Delriviere和Kamada等方法建立大鼠肝移植模型，将大鼠随机分为3组：A组（假手术组）、B组（肝移植对照组）和C组（TMP干预组）。采用全自动生化分析仪检测术后血清肝功能(AST、ALT、LDH)水平；应用免疫组化SP法结合病理图像分析仪测定肝组织中Bcl-2、Bax的表达情况；HE染色观察其病理形态学变化。结果（1）C组AST、ALT、LDH明显低于B组（P<0.01）。（2）C组Bcl-2或Bcl-2/Bax表达明显高于B组（P<0.05），而Bax表达无明显变化（P>0.05）。（3）A组无明显病理形态改变，B组术后肝组织出现明显的病理损害，C组病理变化明显减轻。结论TMP可能通过上调Bcl-2或Bcl-2/Bax表达而减轻肝移植体的低温保存再灌注损伤，对供肝有保护作用。

【关键词】肝移植；保存再灌注损伤；川芎嗪；Bcl-2；Bax

Protectiveeffectoftetramethylpyrazineonlivergraftinratlivertransplantation

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectoftetramethylpyrazine(TMP)preconditioningonlivergraftinratlivertransplantation.MethodsPerformingtheoperationoflivertransplantationinmaleSprague-DawleyratsreferredtoDelriviereandKamadawithcuffanastomosingmethods，theratswererandomlydividedintothreegroups：Agroup(n=6，shamoperationgroup)，Bgroup(n=30×2，livertransplantationcontrolgroup)，Cgroup(n=30×2，TMPgroup).Theparametersofliverfunction(AST，ALTandLDH)weretestedbyauto-biochemicalanalyseringroupBandCafterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectivelyviatheplasmasamples；partofthelivertissuewassampledtodeterminetheexpressionofBcl-2andBax.TheparametersingroupAwereexamed3haftertheoperation.TheexpressionofBcl-2andBaxwasdeterminedbyimmunohistochemistytechniquewithpathologicalimaginganalyser.Also，partsoflivertissuesampleswereusedtodetectthehistopathologicchanges.Results（1）ThelevelsofAST，ALTandLDHweresignificantlydecreasedingroupCcomparedwiththatingroupB（P＜0.01）afterreperfusion0.5h，3h，6h，24h，48hrespectively.（2）TheexpressionofBcl-2weresignificantlyincreasedingroupCcomparedwiththatingroupB（P＜0.01）afterreperfusion0.5h，3h，6hrespectively.ThedifferentexpressionofBaxbetweengroupCandgroupBwasnonsignificant.（3）ApproximatelynormallymorphologicstructurewasfoundingroupA，someobvioushistopathologicchangesingroupBcouldbeseenmorphologically.ButingroupC，somehistopathologicchangeswerealleviated.ConclusionTMPcanimproveliverfunctionandalleviatehistopathologicdamageinlivertransplantationinratsduringpreservationandreperfusioninjuryprobablybyup-regulatingtheexpressionofBcl-2orBcl-2/Baxandexertaprotectiveeffectonlivergraft.

【Keywords】livertransplantation；preservationandreperfusioninjury；tetramethylpyrazine；Bcl-2；Bax

肝移植是治疗终末期肝病最有效的手段，肝移植体低温保存再灌注损伤是肝移植术后肝原发性无功能（PFN）的重要原因，与细胞凋亡密切相关。目前人们针对凋亡发生的各个环节，探索各种防治方法，从而减轻肝移植体保存再灌注损伤成为了研究的热点。川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP，四甲基吡嗪）是从中药川芎中分离、纯化的一种生物碱，TMP具有抑制血小板的聚集、改善微循环、保护血管内皮细胞、对抗氧自由基的氧化作用以及钙拮抗作用；TMP作为钙拮抗剂，可能通过激活腺苷酸环化酶及抑制钙离子内流作用而抑制细胞凋亡［1］；TMP还可以影响c-fos表达而抑制细胞凋亡［2］。但目前TMP在细胞内的分子机制研究甚少，需进一步研究。TMP是否影响移植肝保存再灌注损伤细胞凋亡调控基因的表达，尚未见报道。本实验通过建立大鼠肝移植模型，观察TMP对保存再灌注损伤中肝组织Bcl-2、Bax表达的影响，探讨TMP对大鼠移植肝的保护作用。

1材料与方法

1.1材料封闭群雄性SD大鼠126只，供体体重200～250g，受体体重340～380g，实验动物购于中南大学实验动物中心。SSW-3X显微外科手术器械包（上海医疗器械有限公司）。Q550CW自动病理图像分析仪（德国LEICA公司）。TMP（40mg/2ml/支，北京第四制药厂）。Bcl-2、Bax免疫组化试剂盒、AST、ALT、LDH试剂盒（北京中山生物技术有限公司）。

1.2实验分组及处理封闭群SD大鼠（n=126）随机分为3个组：A组（n=6，假手术组）、B组（n=30×2，肝移植对照组）、C组（n=30×2，TMP干预组）；B、C组再根据再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h不同时相，又分为5个亚组。

1.3制备大鼠肝移植模型参照Delriviere和Kamada等［3］方法建立大鼠肝移植模型。安体醚吸入麻醉，供体肝上上腔静脉结扎，供体肝下上腔静脉与受体右肾静脉按照Delriviere等［4］方法行袖套吻合（套管内径为2.0~2.2mm、外径为2.8~3.0mm）；供肝门静脉与受体门静脉行袖套吻合（套管内径为1.5~1.8mm、外径为2.0~2.2mm）；结扎受体肝固有动脉；最后将供肝胆管与受体胆管采用套管法重建（内径为0.65mm、外径0.96mm硬膜外导管）。B组：灌洗及保存液为4℃冷平衡盐溶液（含肝素钠5u/ml）；C组：灌洗及保存液为冷平衡盐溶液中加TMP（320g/L）；A组：开腹后游离肝周韧带，分离胆总管及门静脉，关腹。

1.4标本的采集和检测B、C组观察术后的一般情况，并分别于肝移植再灌注后0.5h、3h、6h、24h、48h取腹主动脉血待测肝功能（AST、ALT、LDH），同时取移植肝一小块肝组织待制石蜡标本；A组于关腹后3h取标本作为正常对照。采用全自动生化分析仪进行肝功能测定；利用免疫组织化学染色的方法结合病理图像分析测定各切片中细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax表达情况。取部分切片进行常规HE染色，光镜下观察肝组织的病理形态学变化。

1.5免疫组化染色方法石蜡切片常规脱蜡至水；3%过氧化氢阻断内源性过氧化酶活性；微波修复抗原，加封闭用羊血清，37℃孵育15min；加1∶50Bcl-2或1∶50Bax抗体工作液，4℃孵育过夜；滴加生物素的羊抗兔IgM（1∶100），37℃孵育30min；每张切片滴加50μlSP复合物，于37℃孵育30min；以新鲜配制的DAB显色，苏木素复染，封片，显微镜下观察。镜下可见阳性染色主要位于胞浆内，少数为核膜，呈浅黄、棕黄或棕褐色颗粒。每张切片内中外随机选取6个视野，运用病理图像分析仪显微镜下观察并测定阳性细胞的辉度值（与Bcl-2、Bax表达成反比）。

1.6统计学方法所有计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，在计算机上用SPSS11.0软件包处理，方差齐性分析后，组间比较用均数t检验，组内比较用单因素方差分析，组内不同时点间两两比较采用q检验，指标间相关分析用直线相关分析，P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1一般情况本实验肝移植60例，供体手术时间、血管袖套准备时间、受体手术时间、无肝期分别为（29.65±3.18）min、（9.05±2.12）min、（42.64±4.07）min、（5.18±1.23）min。手术成功率为88.33%（53/60）。本实验发现，肝移植TMP干预组较肝移植对照组在供肝恢复血流后，其表面很快呈鲜红色，无花斑状表现，门静脉不扩张，肝脏无肿胀，肠管无淤血，肠系膜动脉搏动有力，胆汁源源不断流出，上述表现明显优于肝移植对照组。

2.2肝组织形态学变化假手术组（A组）无明显形态学改变；肝移植对照组（B组）术后肝组织随着再灌注时间的延长，病理变化逐渐加重：肝细胞排列紊乱，细胞浊肿，变性呈颗粒状，肝窦变窄，中性粒细胞附壁，继而出现细胞核染色加深及部分核浓缩，部分还出现点状或小片状坏死，以术后6h最严重，6h后，病理变化随着再灌注时间的延长逐渐减轻；肝移植TMP干预组（C组）病理变化较B组相应时点明显减轻：轻度的组织水肿，肝窦内皮渗出较少，小叶结构基本完好，炎症细胞浸润较少（见图1～2）。

2.3大鼠各组AST、ALT、LDH含量与A组比较，B、C组各时点AST、ALT、LDH含量均显著性增加（P＜0.01）；与B组相应的时点比较，C组各时点AST、ALT、LDH含量显著性降低（P＜0.01）；B、C组内各时点间AST、ALT、LDH含量单因素方差分析差异显著（P＜0.01），且每两个时点间q检验有显著性时效关系（P＜0.05），见表1。

注：A组AST、ALT、LDH含量分别为（82.78±5.60）u/L、（48.80±4.30）u/L、(564.83±30.66)u/L；与A组比较，△P＜0.01；与B组比较，#P＜0.01

2.4各组Bcl-2、Bax表达辉度值变化与A组比较，B、C组于肝移植缺血再灌注后0.5h、3h、6hBcl-2表达显著性增加（P＜0.01），Bax表达显著性降低（P＜0.01）；与B组比较，C组0.5h、3h、6hBcl-2表达显著性上调（P＜0.01），Bax表达差异无显著性；并且B、C组内各时点Bcl-2、Bax表达差异有非常显著性（P＜0.01），且每两个时点间q检验有显著性时效关系（24h与48h间例外）（见表2、图3～6）。

注：A组Bcl-2、Bax阴性对照值均为（153.09±1.61）/μm2；△与A组各时点Bcl-2值比较，P＜0.01，Bax值P＜0.01；#与B组各时点Bcl-2值比较，P＜0.01，Bax值P＞0.05

2.5肝功能（AST、ALT、LDH）水平与Bcl-2、Bax表达的相关性AST、ALT、LDH水平与Bcl-2的表达呈显著性负相关，r值分别为-0.39（P＜0.05）、-0.51（P＜0.01）、-0.52（P＜0.01）；AST、ALT、LDH水平与Bax的表达呈显著性正相关，r值分别为0.71、0.54、0.75，P＜0.01；AST、ALT、LDH水平与Bcl-2/Bax表达呈显著性负相关，r值分别为-0.73、-0.72、-0.86，P＜0.01。

3讨论

肝移植术后肝原发性无功能是肝移植后死亡的主要原因，与肝移植低温保存再灌注损伤密切相关［5］，其中细胞凋亡在组织细胞的丢失和器官功能衰竭方面发挥着重要作用［6，7］。肝移植体从可逆到不可逆的转变反映了肝细胞的增殖、分化和细胞凋亡的精细平衡，基因调控是细胞凋亡的重要调控机制［8］。

Bcl-2基因家族是最受关注的基因之一，任何一个死亡启动子与Bcl-2或Bcl-XL形成异型二聚体时，细胞就可以避免发生凋亡［9］。Bcl-2蛋白是一种膜整合蛋白，主要分布在线粒体内膜细胞膜内表面、内质网、核膜等处，具有抑制凋亡的作用［10］。目前认为其抗凋亡的主要机制是：抑制细胞内织网钙库释放钙，维持细胞内钙的稳定；恢复线粒体膜电位和调制线粒体内外膜之间通透性转变孔（PTP），抑制线粒体释放促凋亡蛋白质如细胞色素C、凋亡蛋白激活因子（APAF-1）、凋亡诱导因子（AIF）等［11，12］；抑制Caspase如Caspase-9的激活，从而抑制细胞凋亡级联放大反应［13，14］；直接抗氧化，对抗氧化应激所致的细胞凋亡［15］；抑制凋亡蛋白Bax及Bak的细胞毒作用等。本实验结果显示移植肝对照组再灌注0.5h即出现Bcl-2表达增加，与假手术组比较差异有非常显著性（P<0.01），随再灌注时间延长，Bcl-2表达进行性降低，肝功能形态损害进行性加重，再灌注后6h最明显，提示移植肝在保存再灌注损伤中可能通过增加Bcl-2表达而抑制凋亡，但其作用是有限的，随着再灌注时间延长，其抑制作用逐渐减弱。TPP干预组Bcl-2表达比肝移植对照组显著性上调（P<0.01），肝功能形态损害明显减轻，提示TMP可能上调Bcl-2表达，进一步抑制凋亡而保护移植肝。

Bax为Bcl-2家族中的一员，与Bcl-2不同的是，Bax是促进凋亡。其机制可能是通过诱导Caspase的释放来实现的，而Caspase能激活来自线粒体的细胞色素C，因而可能对抗Bcl-2的抑制细胞凋亡作用［16，17］；Bax的过度表达还可以促进细胞因子缺乏介导的细胞凋亡。本实验发现Bax的表达在肝移植后，随着再灌注时间延长逐渐增加，以再灌注6h最明显，后又进行性下降，24h后基本恢复正常（与假手术组比较），提示移植肝保存再灌注期间可能激发Bax表达而促进细胞凋亡，TMP干预对Bax表达无明显影响。

综上所述，川芎嗪可以通过上调Bcl-2或Bcl-2/Bax表达而有效地减轻肝移植体的低温保存再灌注损伤，对供肝有保护作用。但其上调Bcl-2或Bcl-2/Bax表达的具体机制尚有待进一步研究。

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