镍与多基因致癌作用试析论文

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镍是人类生产、生活中的重要金属和人体必需微量元素，同时也是一种多系统、多器官、多细胞毒物。镍化合物已被确认为人类确证致癌物。许多报道认为：镍进入细胞后主要通过自由基作用、DNA-蛋白质交联及碱基甲基化等遗传、非遗传方式致癌［1-5］。我们就镍致癌过程中的多基因变异研究进行回顾，为镍的分子致癌机制研究提供参考。

一、镍与原癌基因的激活

就其本质而言，原癌基因是一类编码关键性调控蛋白的正常细胞基因，对细胞的正常生长有极其重要的作用。当其发生突变或异常表达时，就成为导致细胞恶变的癌基因［6］。在镍的致癌机制中，研究最多的是c-myc、c-ras、c-jun、c-fos癌基因和NFκB蛋白基因。

1.myc基因：myc基因表达DNA结合蛋白，分布于核内，参与RNA的加工、细胞周期调节及细胞分化。正常细胞中通常myc只在细胞分裂早期增加，而在许多癌细胞中均见到其异常表达。Sunderman等［7］在雄性Fisher-344大鼠单侧肾脏注射20mgαNi3S2后，观察到肾癌及多种肉瘤，肿瘤细胞中染色体畸变多见，DNA斑点杂交和图像分析表明：N-myc基因表达明显增强，超出正常细胞6倍。说明Ni3S2明显诱导myc原癌基因的扩增。

2.ras癌基因：ras癌基因由4个外显子组成，编码p21蛋白，它定位于细胞膜内侧，其功能与G蛋白类似，是细胞内重要的信息传导分子。多数癌细胞ras通道被不正常激活。Haugen［8］及Kawanishi等［9］先后发现镍致癌与ras癌基因有关。Kathleen等［10］用硫化镍和硫化亚镍诱发大鼠肾肉瘤后，用PCR方法在肾肉瘤细胞中发现k-ras基因的第12密码子存在GGT→GTT的颠换，而其他密码子未发现突变现象。说明ras基因的第12密码子是镍的选择性攻击位点，ras原癌基因由于点突变而激活。此外，还发现ras基因被不正常激活后，肿瘤发生的潜伏期缩短，这与ras表达蛋白的功能有关。因为p21蛋白是调控细胞生长的重要分子，ras过度表达，细胞生长加速，故潜伏期变短。

3.AP-1(fos/jun)癌基因：c-fos和c-jun癌基因表达产物为核转录因子，是信息通路的核内部分。DNA的转录和蛋白质的表达均与之有关。AP-1癌基因是c-fos和c-jun癌基因的杂合二聚体复合物，也具有上述性质［11］，许多肿瘤与之激活有关。Konstantin等［12］发现镍诱导c-fos和c-jun基因的表达。他们用氯化镍持续染毒BALB/c3T3细胞，结果该细胞株获得了对浓度高达200μmol/L镍的抵抗力(故称B200细胞)。作者研究了镍对B200细胞和野生型3T3细胞AP-1的DNA结合活力，结果发现野生型3T3细胞AP-1的DNA结合力比B200细胞强。由于AP-1基因是c-fos和c-jun的二聚体，故作者随后用Northernblot法分析了c-fos和c-jun的表达，取得了与上述一致的结果。c-jun和c-fos在野生型3T3细胞中表达要强，而B200细胞表达很低。说明镍能诱导转录因子AP-1(jun/fos)的表达。

4.NFκB蛋白基因：NFκB蛋白是结合于增强子的调控蛋白，参与多种细胞因子的活化。镍能诱导该调控蛋白的表达。Konstantin等［12］在比较B200细胞和野生型3T3细胞对镍的不同反应的实验中发现镍对NFκB蛋白有诱导作用。

二、镍与抑癌基因的失活

抑癌基因与癌基因是一对矛盾的统一体，控制着细胞的生长和分化。在正常细胞中，抑癌基因通常处于一定程度的表达；而在肿瘤细胞中，抑癌基因经常丢失或失活。镍的致癌过程与Rb和p53等多种抑癌基因的失活密切相关。

1.p53基因：在镍诱发的人肾上皮恶性转化细胞中，Haugen等［13］观察到p53基因的第238个密码子上有T→C的颠换突变，即TGT→CGT(Cys→Arg)。Mahle等［14］用镍转化人肾上皮细胞，用p144D6、pYNZ22.1和pYNH37.3探针发现恶变细胞17号染色体短臂(17p)缺失。由于p53基因定位于17号染色体短臂，且p53基因变异常伴17号染色体缺失，故用PCR扩增p53基因，DNA测序发现了其238位密码子T→C的突变。Harty等［15］对职业接触镍化合物的肺癌患者病理标本进行基因分析，发现p53基因的5～8外显子存在着G∶C→T∶A型颠换突变。

2.Rb基因：Rb基因最早在视网膜母细胞瘤的患者中发现缺失，随后发现它有重要的抑癌功能。镍的致癌作用也与Rb基因的变化有关。Lin等［16］用晶体硫化镍处理人成骨细胞(HOS)，使HOS细胞发生恶性转化。他们发现：恶变细胞中Rb蛋白(pRb)不能进行磷酸化，不能与SV40大T抗原形成复合物，而只能次磷酸化；当通过Rb表达载体将正常Rb基因转入镍转化的HOS细胞后，该细胞又具有正常表型，呈现接触抑制，且表达的pRb能被磷酸化。说明镍转化细胞中Rb基因失活了。

3.衰老基因：Catherine等［17］发现镍转化的中国仓鼠细胞X染色体长臂(xq)发生完全丢失，细胞获得不死性，并可在裸鼠身上致瘤。将正常细胞的X染色体经微细胞融合技术转入转化细胞后，这些细胞出现死亡。由于X染色体上存在多个衰老基因，推测是镍引起X染色体上衰老基因的失活。Deborah等［18］则在镍转化的叙利亚仓鼠皮肤细胞(SHD)里发现衰老基因的失活，观察到是X染色体上的亚显微间隙基因缺失(sub-microscopicinterstitialgeneticdeletion)所致。

4.血小板反应蛋白(thrombospondin)基因：血小板反应蛋白是一种可接受促分裂原的钙结合蛋白，对血栓块有稳定作用。它在肿瘤发生学上的意义在于能够阻止肿瘤，具有抑制作用，故被认为也是抑癌基因［19］。Salnikow等［20］发现镍转化细胞中有一与血小板反应蛋白基因高度同源的DN断丢失，血小板反应蛋白基因在镍转化细胞中呈低表达。单克隆抗体证明该表达蛋白存在于正常细胞，而在转化细胞中大大减少，说明血小板反应蛋白基因被抑制或失活。

三、镍致原癌基因激活和抑癌基因失活的机制

一般说来，原癌基因和抑癌基因在正常细胞中都只处于低水平的表达，只有在生长信号的刺激下，进入增殖时，癌基因才被激活，表达增强。例如ras基因被激活后，细胞明显增殖，而此时p53基因、Rb基因等抑癌基因表达也增强，对细胞的生长起负调控作用，待细胞生长停止后又复下降。但是如果原癌基因非正常表达增强或抑癌基因非正常失活，结果诱导细胞持续增生或恶变。已知镍引起多种原癌基因激活及抑癌基因失活。据分析，导致这一变化的机制主要有点突变、缺失、扩增、DNA甲基化、染色体浓缩等方式。

1.点突变：以ras癌基因为例，在镍诱导的恶性转化细胞中，多次观察到镍选择性地引起H-ras或K-ras癌基因的第12密码子G→T的突变［9，10］，即从GCT变为GTT，相应的编码氨基酸由甘氨酸变为缬氨酸，单个碱基的变化使该基因处于激活状态，ras基因表达增强。同时，氨基酸的变化改变了编码蛋白p21的构象，使GAP(GTP酶结合蛋白)不能识别和激活p21的GTP酶，于是p21-GTP复合物不能水解成p21-GDP，p21处于持续活化状态，使细胞持续增殖［21］。

抑癌基因的失活也可以通过碱基点突变发生。p53抑癌基因就是如此。在镍诱导恶变细胞和镍工肺癌细胞中均可见到该基因的点突变。例如：人肾上皮细胞受镍转化后，其p53基因的第238密码子上发生T→C的颠换，即由TGT→CGT［13，14］；镍工肺癌细胞可见G∶C→T∶A的突变［15］。这些细胞的p53基因不能表达或表达极为低下。

2.丢失：基因丢失是基因失活的主要方式之一。在肠癌、肺癌等细胞常发生APC、Rb、p53、p16等抑癌基因的丢失。在镍恶性转化细胞中，也常观察到染色体缺失现象，例如17p，xq等部分缺失［14，17，18］，它们与p53及衰老基因的丢失有关。

3.基因扩增：基因扩增常常是癌基因激活及高表达的原因，染色体均染区(HSR)的出现被视为基因扩增的可见证据［22］。在镍所致肾肉瘤细胞及转化细胞中就见到染色体均染区。同时，N-myc基因表达比正常细胞高6倍以上［7］，与人HL-60细胞N-myc基因扩增时见到的细胞遗传学变化一致。

4.碱基甲基化及染色质浓缩：基因的甲基化状态是调节基因表达的重要方式。DNA甲基化和染色体浓缩后造成的空间障碍，既不利于DNA的解链和解旋，又不利于转录因子与模板的结合，故基因表达失活或低下。一般而言，甲基化的基因常不表现活性，而表达的基因常处于非甲基化或低甲基化状态［23］。镍可以通过碱基甲基化而影响基因的表达。例如，镍转化的中国仓鼠细胞的X染色体长臂缺失，呈永生性。当往培养液中加入去甲基剂5-氮胞苷后，细胞逐渐衰老而死亡［17］。说明DNA甲基化是关闭衰老基因的原因。此外，由于镍与异染色质的H1组蛋白有特异性亲和力，能诱导染色质浓缩和甲基化。Lee等［24］证实镍通过这种方式导致G12细胞的gpt基因关闭。他们观察到：在镍处理的培养细胞和游离核中，均可见到gpt基因特殊序列上DNA甲基化和染色质浓缩，相关基因gpt表达失活。若激活gpt基因表达，则DNA甲基化和染色质浓缩现象消失。

5.锌指(zincfinger)结构的改变：镍改变癌基因的表达可能与锌指蛋白有关。锌指蛋白是基因转录中反式作用因子结构上的DNA识别或结合结构域，包括锌指、锌扭(twist)和锌簇(cluster)。其共同特点是通过α螺旋结合于DNA双螺旋结构的主沟中，参与基因转录，其活性依赖于锌离子［25］。锌指结构富含半胱氨酸和组氨酸。由于镍对半胱氨酸和组氨酸具有特殊的亲和力，且与锌同属二价离子，故能与锌竞争性结合氨基酸残基，使锌指变为“镍指”，结果该结构发生扭曲，不能折叠，失去原有的立体结构，不能识别DNA特异位点，不能与之结合［26］。这可能是导致一些镍转化细胞中原癌基因失活不能表达的原因。此外，Sarker等［27］也发现镍能取代锌指结构中的锌，不过作者认为镍取代锌是为了与DNA结合，并通过产生自由基等损伤DNA，从而诱发肿瘤。从空间构象上来说，前者更有说服力。

四、多基因变异与镍致癌的关系

从以上研究可见，镍不但激活原癌基因如c-ras、c-myc、c-fos、c-jun等的表达，而且能抑制抑癌基因如p53、Rb、衰老基因等的表达。它们在镍致癌过程中如何起作用呢?

已经知道细胞的增殖遵循细胞周期，即从G1→S→G2→M→G1。在细胞周期中至少存在两个重要的“生长控制点”(checkpoints)，一是G1→S转变期；一是G2→M转变期。这两控制点都由一些重要癌基因蛋白调控。它们不仅能监控细胞数量的增加，而且能监视DNA损伤情况，阻止DNA损伤的细胞进入分裂期。例如：c-myc基因的表达能使细胞获得通过生长控制点的能力，而c-ras的表达则加强c-myc的这种作用。p53蛋白能使DNA损伤细胞停留在G1期，不进入复制。在正常细胞中，癌基因的表达受细胞生长的调节，也是周期性的。但肿瘤细胞中，基因表达程度和次序发生紊乱，不再具有周期特异性。例如：在苯并(a)芘转化细胞中，c-myc持续性高表达，不具周期性，故细胞持续增殖。再如p53等抑癌基因失活，则损伤细胞仍可复制、增殖。镍诱导染色体畸变和DNA损伤已从许多方面得到了证实，而且由于多方面的作用，镍能引起原癌基因的激活和抑癌基因的失活。这样，一方面使得受损细胞能越过第一生长控制点(G1→S)，同时由于p53、Rb等监控基因的失活，具有DNA损伤的细胞也进入分裂期(G2→M)，使细胞癌变成为可能，并且在原癌基因大量表达的情况下，肿瘤的演变加速。

五、结语

综上所述，镍引起培养细胞的恶性转化和镍工肺癌的过程是一个多基因参与和多基因变异的过程。这些研究为进一步寻找与镍致癌相关的基因提供了依据。已经发现的癌变相关基因就有100多种，而在镍致癌的研究中，前后发现的相关基因也不过10来种。很显然，就镍诱发的染色体、DNA损伤的复杂、多样性来看，与镍致癌相关的基因远不只上述几个，还有更多的基因有待研究。

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