人肝癌细胞凋亡影响半胱氨酸蛋白酶论文

时间:2022-08-24 06:52:00

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人肝癌细胞凋亡影响半胱氨酸蛋白酶论文

【摘要】研究日本新近研制的第三代3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA,HMG-CoA)还原酶抑制剂匹伐他汀(pitavastatin,NK-104)对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响。方法:采用细胞培养技术,以肝癌细胞系HepG2为靶细胞,以不同浓度的药物处理细胞48h后,利用WST-8法测定NK-104对细胞增殖的影响;利用荧光染料Hoechst33258染色,荧光显微镜观察细胞核碎片;以流式细胞仪分析细胞周期的变化;采用半胱氨酸蛋白酶3比色法检测caspase-3活性。结果:NK-104(10μmol/L)对HepG2细胞有明显抑制作用,可诱导HepG2细胞凋亡,并能增强caspase-3基因的活性。结论:NK-104能够诱导HepG2细胞凋亡,其机制与caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。

【关键词】肝癌

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA,HMG-CoA)还原酶抑制剂,统称为抑制素,是重要的脂类合成抑制剂,主要在人体肝脏中代谢,临床上广泛应用于治疗高脂血症[1]。最近研究发现,HMG-CoA还原酶抑制剂具有生物学多效性,与降血脂无关。有报道其在体外具有抗癌作用[2]、体内与5氟尿嘧啶(fluorouracil,5-Fu)共同作用能够延长晚期肝癌患者的生存期[3]。匹伐他汀(pitavastatin,NK-104)是日本新近研制的第三代高效HMG-CoA还原酶抑制剂[4]。在血管内皮细胞系NK-104通过磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/proteinkinaseB,PI3K-Akt)基因激活途径对内皮细胞的保护作用已有报道[5],但其在肝癌细胞系的抗癌作用尚未见报道。本文在肝癌细胞系HepG2通过2-(2-甲氧基-4-硝基苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二硫代苯)-2H-四氮唑单钠盐{[2-(2-methoxy-4-nitrophe-nyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodiumsalt],WST-8}、荧光染料Hoechst33258染色、流式细胞仪和半胱氨酸蛋白酶3比色法等检测方法,研究NK-104对人肝癌细胞凋亡及半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性的影响,为NK-104在抗肿瘤中的作用机制提供实验依据。

1材料和方法

1.1主要材料与仪器NK-104,日本兴和有限公司(日本名古屋)和日产化学工业公司(日本东京)产品;荧光染料Hoechst33258、甲羟戊酸(mevalonicacid,MEV)和碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色液(PI100g/L,1%Triton100,9g/LNaCl),Sigma公司产品。流式细胞仪,2000FCA,美国BD公司产品。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养人肝癌细胞株HepG2(美国ATCC公司产品)在含10%胎牛血清的DMEM培养基、5%CO2、37℃条件下培养。实验中,细胞种植于适当培养皿中,90%的细胞融合时,用磷酸盐缓冲液洗净后,加入适量含有NK-104和MEV(1mmol/L)等药物的培养液,37℃培养箱中培养。

1.2.2WST-8方法利用WST-8试剂盒对细胞增殖进行测定。HepG2细胞(1×104个细胞/孔)接种于含100μl培养液的96孔培养板中,NK-104(0.1~100μmol/L)治疗48h后,分别加入WST-8试剂10μl(日本同仁化学研究所)培养2h后,选择450nm波长,测定各孔的吸光度OD值。

1.2.3Hoechst33258染色细胞经药物刺激48h后,甲醇-冰乙酸(3∶1)细胞固定液4℃固定5min,磷酸盐缓冲液稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min。用滤纸沾去多余液体,封片剂封片后荧光显微镜观察细胞核碎片。

1.2.4流式细胞仪检测凋亡峰在室温下将刺激48h后的细胞用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次,并在适当的染色缓冲液中吸取100μl的细胞(1×105)至试管中。加入200μlRNaseA,37℃水浴30min,再加800μlPI染色液混匀,4℃避光30min后,立即上机分析。

1.2.5半胱氨酸蛋白酶3比色法经药物治疗48h后收集细胞,采用半胱氨酸蛋白酶3比色法试剂盒按照厂家说明进行测定(Medical&BiologicalLaboratoriesCo.,LTD,Japan)。

1.3统计学方法数据均以x±s表示,采用SPSS11.0统计软件进行统计分析,采用t检验。

2结果

2.1NK-104对HepG2细胞增殖的抑制作用为了确定NK-104在人肝癌细胞HepG2中的治疗浓度,采用WST-8方法对细胞的增殖作用进行测定。与对照组相比,NK-104在10和100μmol/L时,对HepG2细胞生长均有明显的抑制作用。100μmol/L时,近50%的细胞死亡(P<0.01)。见图1。

图1不同浓度NK-104对HepG2生长的抑制作用(略)

Figure1GrowthinhibitionofHepG2cellsbyNK-104

**P<0.01,vscontrolgroup.

2.2NK-104诱导细胞凋亡的形态变化对照组细胞界限清晰,胞浆丰富,细胞核呈弥散、均匀荧光分布,经10~100μmol/LNK-104处理后,HepG2发生细胞凋亡,细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化。见图2。

2.3NK-104对HepG2细胞周期的影响与对照组相比,NK-104治疗组可明显诱导HepG2的细胞凋亡,出现相当比例的DNA含量小于二倍体的亚G1凋亡峰(24%),不同周期细胞的比例也发生变化,与MEV共同作用后可消除NK-104的这种诱导作用。见图3。

2.4NK-104对caspase-3活性的影响与对照组相比,NK-104可明显诱导caspase-3活性(P<0.01),同样加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。见图4。

图2NK-104处理48h后HepG2细胞核的形态变化(Hoechst33258染色,×400)(略)

Figure2NuclearmorphologyoftheHepG2cellstreatedbyNK-104for48hours(Hoeschst33258staining,×400)

A:Control,normalnuclearstructure;B:NK-10410μmol/L;C:NK-104100μmol/L;●:Cytoplasmicchange;■:Nuclearfragmentation.

图3NK-104治疗HepG2细胞后细胞周期分布变化(略)

Figure3CellcycleanalysisofHepG2cellstreatedbyNK-104(PercentageofSubG1cells)

**P<0.01,vscontrolgroup.A:Control;B:NK-10410μmol/L;C:NK-104+MEV.

图4NK-104对caspase-3活性的影响(略)

Figure4NK-104inducedactivityofcaspase-3

**P<0.01,vscontrolgroup.TheHepG2cellswereexposedtoNK-104(10μmol/L)alone,orNK-104(10μmol/L)plusMEV(1mmol/L)for48hours.Thecaspase-3activitywasmeasuredwithacolorimetricproteaseassay.

3讨论

目前认为恶性肿瘤是一种多基因异常的疾病,其发生的分子基础是原癌基因的激活或抑癌基因的突变失活或缺失,导致某些细胞分化不良、凋亡受阻和增殖失控而形成肿瘤。原发性肝癌约55%发生在中国[6]。肝癌细胞的凋亡在肝癌的发生发展、转归及治疗等方面均有重要的意义。HMG-CoA还原酶抑制剂,是重要的脂类合成抑制剂,临床上广泛应用于治疗高脂血症。最近研究表明,HMG-CoA还原酶抑制剂具有抗感染、降低炎性细胞因子水平及抗癌等生物学多效性作用。Otsuki等[7]报道1~30μmol/L的西米伐他汀(simvastatin)具有预防癌症的作用。Sutter等[8]研究认为1~10μmol/L的弗鲁伐他汀(fluvastatin)通过诱导Huh7细胞凋亡而抑制肝癌细胞的增殖。Denoyelle等[9]认为25μg/L的赛里伐他汀(cerivas-tatin)对MDA-MB-231人乳腺癌细胞通过抑制细胞核因子κB活性起到重要的抗转移作用。HepG2细胞具有典型肝癌细胞的一系列恶性特征,是研究和评价防治肝癌药物的较理想的细胞模型。NK-104是日本新近研制的第三代HMG-CoA还原酶抑制剂,具有副作用小、高效和强力的药代动力学特点[4]。我们的研究结果表明,NK-104对HepG2细胞增殖有明显抑制作用,其最大抑制率可达50%左右,使HepG2细胞呈现典型的凋亡形态学特征,核质浓集,有凋亡小体。提示NK-104能在一定程度上抑制肝癌细胞的增殖。流式细胞术具有检测的细胞数量大、反映群体细胞的凋亡状态比较准确等优点[10]。NK-104作用于HepG2细胞后,通过流式细胞仪分析,与对照组相比,可见凋亡细胞出现在直方图亚二倍体峰位置,并与细胞主峰G0/G1分界清楚,可定量凋亡占整个细胞群百分比。本研究结果表明,NK-104可明显诱导HepG2细胞凋亡。细胞凋亡的核心成分是半胱氨酸蛋白酶家族(caspase),其中研究最多,功能相对较明确的为caspase-3。caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键蛋白酶之一,为凋亡的效应分子,被称为凋亡的“执行者”[11~13]。激活的caspase-3可裂解相应的胞核内底物DNA修复酶(polyADP-ribosepolymerase,PARP),使PARP失去对DNA的修复功能,导致细胞转向凋亡[14]。本研究表明,10μmol/LNK-104能够增强caspase-3的活性,加入MEV能够消除NK-104的这种诱导作用。这一研究结果表明,NK-104诱导HepG2细胞凋亡与激活caspase-3依赖性凋亡调节信号通路有关。

【参考文献】

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13ZhengSY,GeJF,ZhaoJ,etal.Expressionofcaspase-3geneinhumanlungadenocarcinomacelllineA-549withAd-FasL.ZhongLiuFangZhiZaZhi.2004;11(3):273-277.ChinesewithabstractinEnglish.郑世营,葛锦锋,赵军,等.外源性FasL基因诱导肺癌细胞Caspase-3的表达及凋亡.肿瘤防治杂志.2004;11(3):273-277.

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