亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞表达论文

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【摘要目的摘要：观察亚硒酸钠对大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1表达p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和单核细胞趋化蛋白1(MCP1)的影响，从而探究硒在防治糖尿病肾病（DN）中的功能机制.方法摘要：分别以高葡萄糖、高胰岛素、过氧化氢和糖基化终末产物（AGEs）刺激HBZY1细胞；先给予100nmol/L亚硒酸钠预处理后，再分别以上述4种刺激因素孵育HBZY1细胞，分别检测HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达并比较.结果摘要：4种刺激因素均可作为独立因素，导致HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达量增加；亚硒酸钠能抑制上述4种因素所致的p38MAPK和MCP1的表达.结论摘要：亚硒酸钠通过抑制p38MAPK和MCP1在HBZY1细胞的表达,从而有效防治DN的发生发展，表明硒在DN的防治过程中发挥积极功能.

【亚硒酸钠；p38丝裂原活化蛋白激酶；单核细胞趋化蛋白1；系膜细胞；糖尿病肾病

【中图号R587.24

0引言

近年来国外探究表明单核细胞趋化蛋白1(monocytechemoattractantprotein1，MCP1)和糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）有密切关系［1］.p38MAPK是细胞信号传递的交汇点或共同通路［2-3］，但它在DN发生中的功能及其和MCP1关系仍不十分清楚；硒是机体必需微量元素之一，其缺乏可加剧DN的氧化应激，并可产生拟高血糖病理状态，从而加剧DN的发生发展［4］.但其是否功能于p38MAPK和MCP1国内外未见文献报道.我们分别给予高葡萄糖(HG)、高胰岛素(HI)、过氧化氢(H2O2)和糖基化终末产物(AGEs)孵育HBZY1细胞，观察HBZY1细胞p38MAPK和MCP1的表达以及亚硒酸钠对HBZY1细胞p38MAPK和MCP1表达的影响.从而明确二者在DN形成中的功能及硒在防治DN中的功能机制.

1材料和方法

1.1材料大鼠肾小球系膜细胞系（HBZY1，中国典型培养物保藏中心CCTCC）；新生牛血清、RPMI1640培养液、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（二抗）（北京中山生物技术有限公司）；亚硒酸钠(KarolinskaInstitute赠予)；柱离心式总RNA抽提试剂盒、RTPCR两步法试剂盒、PCR相对分子量标准（TaKaRa公司）；PCR引物合成（上海博亚生物技术有限公司），蛋白质相对分子量标记物（BioRad公司）；磷酸化p38MAPK兔多抗（(Promega公司).

1.2方法

1.2.1细胞系HBZY1的培养HBZY1细胞常规培养于200mL/LRPMI1640培养液中，培养条件为37℃，饱和湿度50mL/LCO2，每2~3日用0.2g/L乙二胺四乙酸（EDTA）消化传代.HBZY1细胞长满培养瓶底40%后分为9组，以无血清培养液饥饿24h,然后按实验分组加入刺激（及干预）因素.

1.2.2体外制备AGEs参考文献［5］，按牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）50g/L，和葡萄糖90g/L，0.5mmol/LEDTA及0.2mmol/LPBS（pH7.4）混匀后过滤除菌，37℃恒温培养箱卵孵育60d.0.1mol/LPBS（pH7.4）中透析48h，测定蛋白含量及荧光强度，分装后存于-80℃冰箱保存备用.

1.2.3实验分组分别以一定浓度HG,HI,H2O2和AGEs刺激细胞系HBZY1一定时间；先给予亚硒酸钠100nmol/L预处理HBZY1细胞48h后，再分别以上述4种刺激因素（浓度、时间同前）孵育HBZY1细胞，同时设对照组.分组情况如下摘要：①对照组摘要：用等体积PBS培养细胞;②HG组摘要：用25mmol/L葡萄糖刺激HBZY1细胞72h;③HI组摘要：用100nmol/L胰岛素刺激HBZY1细胞24h;④H2O2组摘要：用100μmol/LH2O2刺激HBZY1细胞1h;⑤AGEs组摘要：用100mg/LAGEs刺激HBZY1细胞6h;⑥亚硒酸钠+HG组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和25mmol/L葡萄糖分别刺激HBZY1细胞48h和72h;⑦亚硒酸钠+HI组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和100nmol/L胰岛素分别刺激HBZY1细胞48h和24h;⑧亚硒酸钠+H2O2组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和100μmol/LH2O2分别刺激HBZY1细胞48h和1h;⑨亚硒酸钠+AGEs组摘要：依次以100nmol/L亚硒酸钠和100mg/LAGEs分别刺激HBZY1细胞48h和6h.

1.2.4RTPCR法检测MCP1mRNA表达以柱离心式总RNA抽提试剂盒提取细胞系HBZY1总RNA，测定总RNA浓度，计算纯度，A260nm/A280nm均在1.8～2.0之间.MCP1引物序列按文献［6］摘要：上游引物摘要：5′ATCACCAGCAGCAGGTGTCCCAAAGAAGCT3′；下游引物摘要：5′AGAAGTGCTTGAGGTGGTTGTGGAAAAGAG3′，扩增片段长度258bp.βactin引物序列摘要：上游引物摘要：5′TCCTCTGACTTCAACAGCGACACC3′;下游引物摘要：5′TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGG3′，扩增片段长度228bp.以两步法RTPCR试剂盒进行反转录扩增，扩增条件摘要：94℃变性30s，55℃退火1min,72℃延伸1min,共35个循环，72℃最后延伸7min.每次PCR反应至少重复3次.PCR产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳，结果经图象分析系统扫描存图，并对目的条带进行密度分析.

1.2.5Westernblot法检测p38MAPK蛋白表达培养的细胞系HBZY1，经4℃胞浆蛋白提取液裂解，提取物在冰上孵育2h，然后12000g4℃离心10min，沉淀加入4℃预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1h，再12000g4℃离心30min，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量.磷酸化p38MAPK表达量采用Westernblot法检测，核蛋白中加入等体积2×上样缓冲液煮沸5min.进行10mol/LSDSPAGE，将蛋白转至PVDF膜后用5g/LBSA室温下封闭2h，分别用1∶2000抗磷酸化p38MAPK兔多抗4℃孵育过夜，用PBS充分洗涤，再用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG1∶5000，37℃孵育1h，用PBS充分洗涤，DAB显色试剂盒显色.结果经图象分析系统对目的条带进行扫描存图并进行密度分析.

统计学处理摘要：资料采用SAS8.0进行统计分析，组间两两比较用非参数统计分析，P%26lt;0.05即认为有统计学差异.

2结果

2.1细胞系HBZY1MCP1mRNA表达细胞系HBZY1MCP1mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析，HG，HI，H2O2和AGEs均可作为独立因素使细胞系HBZY1MCP1mRNA表达量均明显增加（P%26lt;0.01，表1，图1）.

表1各组细胞系HBZY1MCP1RTPCR和磷酸化p38MAPKWesternblot半定量结果（略）

2.2细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分，HG，HI，H2O2和AGEs均可作为独立因素激活p38MAPK，使细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达明显增加（P%26lt;0.01，表1，图2）.

图1RTPCR法检测各组细胞系HBZY1MCP1mRNA和βactinmRNA表达（略）

图2Westernblot法检测各组细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白和βactin蛋白表达（略）

2.3细胞系HBZY1MCP1mRNA表达细胞系HBZY1MCP1mRNA表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析.亚硒酸钠预处理后，再分别给予以上4种刺激因素孵育细胞系HBZY1，可见MCP1mRNA表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组明显减少（P%26lt;0.01，表1，图1）.

2.4细胞系HBZY1磷酸化p38MAPK蛋白表达的影响HBZY1细胞磷酸化p38MAPK蛋白表达以βactin作为内参照物调整后进行半定量分析.先以亚硒酸钠预处理细胞系HBZY1后，再分别给予上述4种刺激因素刺激细胞系HBZY1，可见磷酸化p38MAPK蛋白表达量分别较相应未经亚硒酸钠预处理各组显著减少（P%26lt;0.01），但和对照组比较仍有显著差异（P%26lt;0.01，表1，图2）.

3讨论

本探究结果显示HG,HI,H2O2和AGEs均可单独诱导细胞系HBZY1，使其MCP1mRNA表达量明显增加.4种刺激素诱导HBZY1细胞MCP1mRNA表达增加的机制，结合文献和实验结果我们认为有以下几点摘要：①高糖有直接刺激MCP1mRNA及蛋白表达增高的功能，该功能是PKC，MAPKs所介导，这可能是DN时肾小球中单核巨噬细胞浸润的重要原因;②大量AGEs可以和系膜细胞上的AGEs受体（RAGE）相互功能，使IκB磷酸化而导致NFκB激活；新近的探究表明［8］，AGEs和AGEs受体（RAGE）相互功能可消耗细胞内谷胱甘肽，产生大量的氧自由基，从而导致细胞内信号传导改变，激活核转录因子NFκB/AP1.同时NFκB也是调节RAGE表达的一个启动子，它的位点1和位点2的激活可使RAGE表达上调，NFκB的激活作为一种正反馈，又进一步促进了AGEs和RAGE的结合，导致NFκB的持续活化，而活化的NFκB可以上调MCP1mRNA和蛋白表达，从而在糖尿病所致肾脏损害中发挥重要功能;③过氧化氢可导致系膜细胞氧化应激加剧，诱导细胞内ROS产生，从而迅速激活NFκB，上调MCP1表达，在DN发生发展早期起重要功能［8］;④HI可能是通过激活PKC，MAPKs信号通路，引起系膜细胞氧化还原状态发生变化，使细胞内ROS产生增加，导致NFκB激活，从而使MCP1表达上调.

MCP1介导糖尿病肾小球损伤.MCP1不仅对血液中单核细胞有很强的趋化活性，也能通过激活转录因子NFκB和AP1来诱导非炎症细胞产生细胞因子和黏附分子，在诱导单核细胞迁入内皮下间隙及渗入肾小球的过程中起重要功能［7-8］；同时，渗入到肾小球的单核巨噬细胞反过来又刺激局部肾小球细胞，在巨噬细胞衍化生长因子如PDGF和TGFβ等功能下导致系膜增生和细胞外基质聚集；此外通过炎症细胞因子功能，还可上调黏附分子和趋化因子的分泌，从而进一步有利于白细胞渗入到肾小球［7］.近年来通过细胞实验及对人和实验动物DN的探究发现，MCP1在DN的发病机制中起重要功能.

p38MAPK可被多种细胞外刺激激活，导致细胞生长、增殖、分化和调控某些因子表达［9-11］.本探究以糖尿病时存在的4种应激因素孵育大鼠肾小球系膜细胞系HBZY1，可见p38MAPK被激活，磷酸化表达增加.

硒是机体必需微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶的重要组成部分，缺硒可出现拟高血糖症病理状态，引起白蛋白尿和肾小球硬化，从而加剧DN的发生发展；补充硒不仅可预防氧化应激，而且可防止肾脏损伤［4,12］.本探究结果还显示，亚硒酸钠具有类似p38MAPK抑制剂所产生的功能，其机制可能是摘要：①通过保护系膜细胞免遭氧化损伤而抑制MCP1的分泌；②通过抑制p38MAPK信号通路而抑制MCP1在系膜细胞的表达.表明亚硒酸钠可能通过抑制p38MAPK而延缓DN的发生发展，但亚硒酸钠是否通过抗氧化而抑制p38MAPK亦或功能于信号通路的其它环节尚需进一步深入探索，提示硒在防治DN发生发展过程中发挥着积极功能.

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