人肺上皮细胞蛋白酶激活论文

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【摘要目的摘要:蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,PARs）广泛分布在多种组织细胞上，但4种PARs在肺上皮细胞的表达情况尚不清楚.我们用A549细胞探究PARs在肺上皮细胞的表达.方法摘要:采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系A549细胞PARs的表达情况.结果摘要:4种PARs在肺上皮细胞上均有不同程度的表达.结论摘要:肺上皮细胞同时表达PAR1~44种受体，这为进一步探究PARs在肺上皮细胞的功能奠定了基础.

【蛋白酶激活受体；肺上皮细胞；RTPCR；流式细胞术；免疫荧光细胞染色

0引言

蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,PARs）属G蛋白耦联受体家族，目前共发现4个成员摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切PAR的N末端，暴露含有系锁配体的新的N末端，可自我激活PAR功能［1］.探究显示，PARs分布在多种组织细胞上，包括血小板、白细胞、肥大细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、消化道上皮细胞等.PAR被激活后，可介导跨膜信号转导从而参和凝血、炎症、变态反应等生理和病理过程的发生［2］.许多组织上皮表达的PARs可能在不同的病理过程中起功能，虽然一些组织的PARs的分布已有探究，但4种PARs在肺上皮的表达情况和功能还不是十分清楚.因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞探索四种PARs在肺上皮细胞上的表达特征.

1材料和方法

1.1材料

人肺癌上皮细胞系A549细胞购自中国科学院上海细胞探究所,青、链霉素、非酶性细胞分离液购于Sigma公司，DMEM培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，TRIZOLReagent购自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,购自TAKARA公司，SYBRGreenI核酸凝胶染料购自BMA公司,PCRMarkers购自Biolabs公司.PE标记的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗体及相应的同型对照均购自SantaCruz公司.FITC标记的羊抗兔IgG二抗购自BDPharmingen公司.PCR仪PTC200购自MJResearch公司，激光扫描共聚焦显微镜系统购自日本Nikon公司，FACSCalibur流式细胞仪购自BectonDickinson公司.

1.2方法

1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞接种于50mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100g/LFBS，1×105u/L青霉素和100mg/L链霉素），于37℃,50mL/LCO2培养箱中培养.

1.2.2RTPCR收集培养的A549细胞，用TRIZOLReagent提取细胞总RNA，具体操作步骤按试剂说明进行.RNA经10g/L琼脂糖电泳后，按TAKARARTPCRkit说明进行cDNA合成.逆转录的条件为摘要：oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合成.βactin（F）5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）5′CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R）5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）5′GGATCGCCTACCACCTGCGTG3′，（R）5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactin的PCR扩增条件为摘要：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR扩增条件为摘要：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4扩增的目的片段分别为500,461,403和401bp；βactin的扩增片段为202bp.PCR扩增片段经测序验证.

1.2.3流式细胞术分析待培养细胞生长至70%~80%时，用非酶性细胞分离液悬浮细胞，10g/LBSA/PBS洗2次，调整细胞密度为5×109~1×1010/mL，40g/L多聚甲醛室温固定10min,按说明书分别加入1∶20PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、1∶20抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500μL1×PBS悬浮细胞，使用流式细胞仪CELLQUEST软件检测和分析上皮细胞PAR的表达情况.

1.2.4免疫荧光细胞染色将A549细胞接种于8孔显微镜玻片培养过夜，用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min，加入1∶20的PE标记的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗体及相应的同型对照抗体，室温避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3，PAR4管再加入FITC标记的羊抗兔Ig二抗，室温避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦显微镜下观察.

2结果

2.1肺上皮细胞PARsmRNA的表达肺上皮细胞表达PAR1，PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，扩增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4mRNA的长度分别为500,461,403和401bp（Fig1）.

2.2肺上皮细胞PARs蛋白质的表达流式细胞仪检测发现肺上皮细胞表达PAR1，PAR2，PAR3和PAR4，其中PAR4的表达为最强，PAR1和PAR3的表达水平较相似，PAR2的表达水平最弱.免疫荧光细胞染色分析进一步证实上述PARs在肺上皮细胞上的表达（Fig2）.

Fig2ImmunofluorescencestainingofPARsonlungepithelialcells

图2免疫荧光细胞染色分析检测肺上皮细胞PAR的表达

3讨论

PARs家族共有PAR1，PAR2，PAR3和PAR44个成员，凝血酶可激活PAR1、PAR3和PAR4，而PAR2可被胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶和活化的凝血因子Ⅹ所激活［3-5］.另外，这些受体还可被相应的PARs激动肽所激活.其中PAR1是凝血酶的高亲和力受体，而PAR4只能被高浓度凝血酶激活.探究显示，凝血酶通过PAR1和PAR4途径协同互补介导血小板的活化，而PAR3作为PAR4的辅助因子，在血小板活化中也起着一定功能［6］，除参和凝血外，多种细胞类型PARs的广泛激活还可参和血管损伤反应［7,8］.PAR2的激活可参和细胞因子及炎症介质的释放,增加微血管的渗出以及中性粒细胞的趋化,血管扩张,血管收缩,细胞增殖等炎症的病理过程.此外，在不同的生理和病理条件下，体内不同的内源性蛋白酶的存在，可能会激活同一细胞上的PAR2.

我们利用RTPCR、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术检测到了4种PARs在肺上皮细胞上的表达.肺上皮细胞作为首先接触吸入性抗原的组织细胞之一，在变态反应性疾病的发病机制中起重要功能，它能够合成和释放许多前炎症细胞因子和趋化性细胞因子，包括IL1，IL6，IL8，GMCSF，MIP，RANTES和eotaxin等［3,9］，还可以合成抗炎因子如PGE2和NO［10］.通过这些因子的功能来募集、激活炎症性细胞从而调节机体的炎症过程，尤其是PAR2的激活可多方面参和肺部炎症的发生和发展.我们也曾经用胰蛋白酶和PAR2激动肽激活肺上皮细胞，诱导其产生了趋化性细胞因子MCP1［11］，但其释放的机制及肺上皮细胞表达PARs的生理和病理生理意义还有待进一步的探索.

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