脊神经根所致脊髓运动论文

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【摘要目的摘要：探索脊神经根性撕脱伤后脊髓运动神经元中Eta1mRNA表达的意义.方法摘要：首先建立脊神经根性撕脱伤的动物模型，采用原位杂交和免疫组织化学方法检测损伤前后Eta1mRNA在脊髓运动神经元中表达的变化.结果摘要：损伤前Eta1在脊髓运动神经元中微量表达.损伤后3d，损伤侧脊髓运动神经元总数减少31.6%，但表达Eta1的运动神经元数量增加52.5%.结论摘要：脊神经根撕脱后Eta1在脊髓运动神经元内上调表达可能是对神经元本身的一种保护.

【Eta1；脊髓；脊神经根/损伤

0引言

Eta1是一种磷酸化糖蛋白［1］，在中枢神经系统的炎症［2,3］及创伤愈合过程中起到一定功能.然而，有关脊神经根性撕脱伤后Eta1mRNA在脊髓运动神经元中表达的变化及意义尚无相关报道.我们建立脊神经根撕脱的动物模型，探究脊神经根撕脱是否可以改变Eta1在大鼠脊髓运动神经元中的表达水平.

1材料和方法

1.1材料

雄性Wistar鼠8wk龄，体质量200g，30只.用14g/L氟烷及1.5L/minO2对动物行吸入麻醉，于髂嵴上方作左旁正中切口，长约2.5cm.沿中线剥离左侧最长肌，并用小剪刀剪除L5横突.将经过L5横突的L3,L4神经根和四周组织分开，用小钩将其轻轻提起，并用小血管钳将其从椎间孔拉出，逐层关闭切口，制成L3,L4神经根的椎管外撕脱模型.术后1，3，7，14或21d处死动物.如文献［4］所述方法，在戊巴比妥麻醉下，通过灌注泵用冷生理盐水及40g/L的低温多聚甲醛（溶于pH7.4的PBS中）对实验鼠进行心内灌注.收集含有L3，L4脊髓的组织块，于固定液中4℃过夜固定，然后低温保护于含200g/L蔗糖的PBS溶液中过夜.用恒温切片机(LeicaMicrosystems,Wetzlar,Germany)切取12μm的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载玻片上.

1.2方法Nissl染色，利用甲酚紫对切片进行染色.原位杂交，依文献［5］所述进行体外转录.用BamHI或XbaI切割含有鼠ETA1cDNA序列（核苷酸从259到1025）的pCRⅡ质粒(Invitrogen)，使之线性化.按照操作说明书，利用digoxigeninRNA标记物（Roche）及SP6,T7的RNA聚合酶（Takara），从线性化的质粒中进行正义、反义RNA探针的体外转录.用文献［6］所述方法的改良法进行原位杂交.以正义探针杂交组作为阴性对照.原位杂交反应后，PBS清洗切片5min，然后和一抗在4℃下反应过夜.一抗为单克隆小鼠抗NeuN抗体(1∶400).切片用PBS冲洗3次以上，每次10min.最后和Alexa荧光488共轭的羊抗小鼠IgG抗体反应并用荧光固定剂(DakoCytomation,Copenhagen)固定于载玻片上.如文献［5］所述进行免疫组化反应.一抗是鼠抗神经细胞核抗体(NeuN;1∶400;ChemiconInternational,Temecula,Calif).随机从切片中同侧及对侧的脊髓前角选取0.147mm2大小的范围，计数NeuN和Eta1阳性细胞.

统计学处理摘要：采用方差分析评估组间差异，并用LSD法进行均数间的多重比较.P%26lt;0.05为有显著意义.

2结果

脊神经根撕脱伤可造成脊髓运动神经元的逐渐减少（Fig1A,B）.从伤后3d起，损伤侧前角运动神经元数目开始明显减少，而同期对侧前角运动神经元的减少则不明显.运动神经元的减少随时间显著增加，在伤后21d时，伤侧已有50%以上的运动神经元降解，伤侧运动神经元的数量为对侧的45%（Fig2）.此时对侧运动神经元的减少和对照组比较也有显著差异（P%26lt;0.05）.在正常对照组运动神经元细胞内观察到Eta1mRNA的微弱表达（Fig3A）.损伤后3d，在伤侧运动神经元细胞中的杂交信号水平升高（Fig3B）.在21d时，Eta1mRNA的表达恢复到正常水平.NeuN的荧光免疫组化及Eta1的原位杂交（Fig4A，B）两种方法证实Eta1在运动神经元细胞的表达.伤后3d，比较损伤侧及对侧的前角运动神经元（NeuN阳性）表达Eta1的细胞数量，虽然伤侧NeuN阳性的神经元细胞数量减少31.6%，但表达Eta1的细胞数量增加了52.5%（Fig5）.

3讨论

本实验提示，脊神经根撕脱后，Eta1在脊髓运动神经元中的表达上调.虽然由于神经元的死亡，脊髓前角中NeuN阳性的神经元减少，但Eta1阳性的神经元细胞数量是增加的.这表明撕脱伤引起运动神经元细胞中Eta1表达的上调，以此对运动神经元起保护功能.Chabas等［7］报道，在实验性自身免疫脑脊髓炎的急性期和复发期，Eta1在脑和脊髓的小神经胶质细胞及神经元细胞中均有表达，而在缓解期无表达.因为脊神经根撕脱伤模型也可被视为中枢神经系统［8］炎性反应的模型，所以这两个独立实验的相似结果，进一步证实Eta1在神经元细胞中可能存在保护功能.另外，在其他一些实验中发现的结果，如Eta1可以保护肿瘤细胞［9］，还能促进培养细胞的发育，防止培养的皮质神经元缺氧死亡［10］也支持这一论点.］

综上所述，在脊神经根撕脱伤后的运动神经元中可观察到Eta1表达的上调.我们认为Eta1在中枢神经系统中可能存在着不同于促进炎症反应的其他功能，即保护神经元细胞抵御iNOS介导的降解的功能.致谢摘要：大阪大学Dr.ShintaroNomura提供含有Eta1cDNA序列的质粒.

【参考文献

［1］唐红卫，潘阳林，聂勇战，等.Osteopontin特异性siRNA真核表达载体的构建及其在GC9811胃癌细胞中沉默效应的鉴定［J］.第四军医大学学报，2004;26（3）摘要:202-205.

TangHW,PanYL,NieYZ,etal.ConstructionofeukaryoticexpressionvectorofsiRNAspecificforosteopontinandcharacterizationofitsefficiencyinGC9811gastriccarcinomacellline［J］.JFourthMilMedUniv,2004;26（3）摘要:202-205.

［2］KimMD,ChoHJ,ShinT.Expressionofosteopontinanditsligand,CD44,inthespinalcordsofLewisratswithexperimentalautoimmuneencephalomyelitis［J］.JNeuroimmunol,2004;151(12)摘要:78-84.

［3］MoonC,ShinT.IncreasedexpressionofosteopontininthespinalcordsofLewisratswithexperimentalautoimmuneneuritis［J］.JVetSci,2004;5(4)摘要:289-293.

［4］陶发胜，李辉，李云庆，等.大鼠脊髓前角神经元内维生素D依靠性钙结合蛋白和小白蛋白共存［J］.第四军医大学学报，2004;25（18）摘要:1645-1647.

TaoFS,LiH,LiYQ,etal.CoexisfenceofcalbindinD28kwithparvalbumininneuronsofspinalcordanteriorborninrats［J］.JFourthMilMedUniv,2004;25（18）摘要:1645-1647.

［5］HashimotoM,KodaM,InoH,etal.Upregulationofosteopontinexpressioninratspinalcordmicrogliaaftertraumaticinjury［J］.JNeurotrauma,2003;20摘要:287-296.

［6］IkedaO,MurakamiM,InoH,etal.Acuteupregulationofbrainderivedneurotrophicfactorexpressionresultingfromexperimentallyinducedinjuryintheratspinalcord［J］.ActaNeuropathol,2001;102摘要:239-245.

［7］ChabasD,BaranziniSE,MitchellD,etal.Theinfluenceoftheproinflammatorycytokine,osteopontin,onautoimmunedemyelinatingdisease［J］.Science,2001;294摘要:1731-1735.

［8］LindholmT,CullheimS,DecknerM,etal.ExpressionofneuregulinandErbB3andErbB4afteratraumaticlesionintheventralfuniculusofthespinalcordandintheintactprimaryolfactorysystem［J］.ExpBrainRes,2002;142摘要:81-90.

［9］FisherLW,TorchiaDA,FohrB,etal.FlexiblestructuresofSIBLINGproteins,bonesialoprotein,andosteopontin［J］.BiochemBiophysResCommun,2001;280(2)摘要:460-465.

［10］MellerR,StevensSL,MinamiM,etal.Neuroprotectionbyosteopontininstroke［J］.JCerebBloodFlowMetab,2005;25(2)摘要:217-225.