血吸虫病肝纤维化治疗论文

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【摘要目的摘要：探索维生素E(VitE)抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化功能及其机制.方法摘要：用日本血吸虫尾蚴皮肤敷贴法感染小鼠，构建日本血吸虫病肝纤维化模型，以肝纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为开始VitE治疗标志.实验分5组摘要：正常对照组、模型组及VitE高、中、低剂量组(每日150,50,5mg/kg),8wk末处死动物，HE和VG染色对肝组织进行病理学检查，分光光度法检测肝组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，免疫组化SP法检测肝星状细胞(HSC)标记物α平滑肌动蛋白(αSMA)表达，RTPCR方法检测肝脏α1(I)型前胶原mRNA表达.结果摘要：VitE降低模型组肝脏MDA含量［(5.00±0.31)μmol/gvs(11.66±1.84)μmol/g,P%26lt;0.05］，提高SOD活性［(249.84±26.22)μkat/gvs(120.11±42.61)μkat/g,P%26lt;0.05］；减少αSMA阳性表达［(0.41±0.02)vs(0.68±0.02),P%26lt;0.05］；降低肝脏胶原含量［(0.23±0.01)vs(0.60±0.11),P%26lt;0.05］和α1(I)型前胶原基因表达［(0.28±0.01)vs(0.85±0.15),P%26lt;0.05］.结论摘要：VitE具有抗小鼠日本血吸虫病肝纤维化功能，其机制和抗脂质过氧化功能、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前胶原基因表达和胶原合成有关.

【血吸虫病，日本；肝硬化；维生素E；氧化性应激；肝星状细胞；胶原I型

日本血吸虫病是我国危害最大的寄生虫病之一，而肝纤维化是日本血吸虫病致死和形成严重并发症最重要的原因.探究表明，在血吸虫病肝纤维化形成过程中，氧化应激发挥重要功能，参和血吸虫对宿主的损伤，自由基可能是血吸虫病主要的致病因素［1］.VitE作为机体防御氧化应激损伤的重要抗氧化剂，已应用于治疗肝纤维化，但有关VitE抗日本血吸虫病肝纤维化功能的探究国内外报道甚少，而VitE治疗血吸虫病肝纤维化的功能机制尚未见文献报道.我们观察VitE抗日本血吸虫病肝纤维化功能，探索其机制如下.

1材料和方法

1.1材料健康雄性昆明小鼠(18～22)g及日本血吸虫尾蚴阳性钉螺(湖北省血吸虫病防治探究所)，皮肤敷贴法感染日本血吸虫尾蚴（20±1）条/只，于感染后8,10,12wk末分别处死6只小鼠后取肝组织进行病理学检查，以肝纤维化达Ⅱ级或Ⅱ级以上作为VitE开始治疗的标志，即在12wk末开始给予VitE治疗.32只感染小鼠分为4组，每组8只摘要：1组，模型组；2组，VitE高剂量组(VitE每日150mg/kg)；3组，中剂量组(50mg/kg)；4组，低剂量组(5mg/kg).VitE胶丸由厦门鱼肝油厂生产，剪破胶丸，用蒸馏水配制所需浓度的混悬液，灌胃给药每日1次，连续8wk.另取同一批健康小鼠10只作为正常对照组.丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒(南京建成生物工程探究所)，免疫组化所用试剂(北京博奥申生物技术有限公司)，TRIzol(美国Invitrogen)，逆转录试剂盒(美国Promega)，Taq酶(Gibco公司).α1(I)型前胶原引物序列参照GenBank，上游序列摘要:5′GAGCGGAGAGTACTGGATCG3′，下游序列摘要:5′TGCTGTAGGTGAAGCGACTG3′，扩增片段为419bp；内参照βactin引物上游序列摘要:5′TGTCACCAACTGGGACGATA3′，下游序列摘要:5′AGGTCTTTACGGATGTCAACG3′，扩增片段为654bp，引物由北京奥科生物技术有限公司合成.

1.2方法断颈处死小鼠，取肝右叶相同部位肝组织2块，1块于-70℃保存，测定肝组织匀浆MDA含量、SOD活性及肝脏α1(I)型前胶原基因表达；1块固定于100mL/L中性甲醛，石蜡包埋，行HE和VG及αSMA免疫组化染色.

1.2.1肝组织病理学及纤维化评分常规行HE和VG染色，光镜下观察肝小叶病理变化及肝纤维化程度分级摘要：0级20=1，正常；Ⅰ级21=2，胶原纤维包绕虫卵肉芽肿四周；Ⅱ级22=4，汇管区有大量纤维，小叶间仅有少量纤维；Ⅲ级23=8，纤维组织大量延伸至肝小叶间.应用HPIAS1000高清楚度彩色病理图文分析系统，每组每次测量20～30个由单个成熟虫卵形成的肉芽肿两个直角相交直径，以(最大横径+最大纵径)/2为平均值，并计算各组均值；测定VG染色切片胶原纤维灰度面积(S)和视野总面积(T)，用S/T比值表示胶原含量.

1.2.2肝组织匀浆MDA含量和SOD活性测定硫代巴比妥酸比色法测定肝脏MDA含量，黄嘌呤氧化法测定SOD活性，按试剂盒说明书要求操作.

1.2.3肝脏αSMA免疫组化采用SP法，兔抗鼠αSMA抗体稀释度1∶100，用已知阳性片做阳性对照，PBS液代替一抗做阴性对照，细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞.应用HPIAS1000高清楚度彩色病理图文分析系统对αSMA免疫组化切片进行平均吸光度值检测.

1.2.4肝脏α1(I)型前胶原基因表达应用TRIzol试剂盒，参照说明提取肝组织总RNA，逆转录合成cDNA，采用20μL反应体系.PCR反应条件摘要：95℃变性5min,94℃30s,94℃30s,52.7℃退火30s,72℃延伸30s，循环30次，最后72℃终止10min，以βactin为内参照.PCR产物分析摘要：PCR产物经2kg/L琼脂糖凝胶2μL电泳检测，结果照相并存入凝胶分析系统，以βactin光密度值标化α1(I)型前型胶原基因光密度值，得到α1(I)型前胶原基因相对含量.

统计学处理摘要：采用SPSS12.0统计软件对结果进行统计学分析，数据均采用x±s表示，采用方差分析进行比较，P%26lt;0.05为差异有统计学意义.多组均数间的多重比较采用LSD法.

2结果

2.1肝脏病理学变化对照组无明显组织学异常.1组摘要：HE和VG染色示小鼠血吸虫病肝纤维化模型建立成功.血吸虫感染后8wk，虫卵肉芽肿大小和数量达到高峰，大量炎性细胞浸润；随感染时间延长，肉芽肿逐渐缩小，肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润明显减轻，胶原纤维逐渐增多.至20wk，胶原纤维由最初的细线状变为条索状或网状分布在汇管区、虫卵肉芽肿四周并延伸至肝小叶间(图1A，B).VitE组肉芽肿大小和1组比较无显著差异(P%26gt;0.05)，对肝细胞变性、坏死和炎性细胞浸润程度影响不明显；2，3组虽有不同程度肝纤维化，但纤维带变细、窄、短，胶原纤维局限于汇管区和肉芽肿内及四周，肝小叶间很少有胶原沉积(图1C)，和1组比较，肝纤维化程度分级差异有显著性(P%26lt;0.05).4组和1组比较无明显差异(表1).

2.2肝脏MDA含量和SOD活性和对照组比较，1组SOD活性下降(P%26lt;0.05)，MDA含量增多(P%26lt;0.05)，有统计学意义.2,3组SOD活性和1组比较升高(P%26lt;0.05)，但和对照组比较仍相差甚远(P%26lt;0.05)；2,3组MDA含量和1组比较减少(P%26lt;0.05)，2组和对照组比较无显著性差异(P%26gt;0.05)；4组和1组比较无明显差异(表1).

A摘要:模型组×100;B摘要:模型组×200;C摘要:VitE组×100.

图1肝脏胶原纤维分布VG

2.3肝脏αSMA表达对照组肝脏血管壁、胆管壁平滑肌有少许αSMA阳性表达，汇管区及肝窦内基本无αSMA阳性表达；1组汇管区、虫卵肉芽肿内及四周胶原纤维沉积处可见大量索状αSMA阳性表达细胞，肝窦内可见多量αSMA阳性表达细胞(图2A,B)；2,3组αSMA阳性细胞数目减少(P%26lt;0.05)，局限在汇管区、纤细的纤维隔及肉芽肿内及四周，肝窦内表达减少(图2C)；4组和1组比较无明显差异(表1).

A摘要:模型组×100;B摘要:模型组×200;C摘要:VitE组×100.表1VitE对虫卵肉芽肿直径、MAD含量、SOD活性、αSMA平均吸光度值及肝纤维程度的影响

2.4肝脏α1(I)型前胶原基因表达和胶原含量1组(即感染20wk末)α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量高于感染12wk时(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)和对照组(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05).2,3组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量和1组比较差异有显著性(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)；2组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量和感染12wk时比较有显著性差异(P%26lt;0.05和P%26lt;0.05)，而3组无统计学意义(P%26gt;0.05)；4组和1组比较无明显差异(图3，表2).

M摘要:marker;1摘要:模型组;2摘要:感染12wk;3摘要:VitE高剂量组;4摘要:VitE中剂量组;5摘要:VitE低剂量组.

图3RTPCR分析各组α1(I)型前胶原mRNA表达表2VitE对胶原含量和α1(I)型前胶原基因表达的影响

3讨论

氧化应激是多种病因所致肝纤维化发生发展的重要环节之一［2］.VitE作为体内一个重要的抗氧化剂，有抗肝纤维化［3-5］、抗肿瘤、抗衰老等功能.宗道明等［5］探究表明，VitE可降低血吸虫病肝纤维化患者血清肝纤维化各项指标，对肝纤维化组织形态学的好转有积极功能，治疗血吸虫病肝纤维化疗效显著.但目前有关VitE抗血吸虫病肝纤维化机制少见文献报道.

Chojkier等［6］探究表明，VitE抑制HSCα1(I)型胶原基因表达.我们发现，VitE降低肝脏α1(I)型前胶原基因表达、胶原含量及肝纤维化程度分级；2组α1(I)型前胶原mRNA和胶原含量显著低于感染12wk时.可见VitE可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻肝纤维化程度.本探究中，1组MDA含量增加，SOD活性下降，说明日本血吸虫病肝纤维化之肝脏发生氧化应激反应，产生脂质过氧化损伤，和文献［1］报道一致，而VitE能够不同程度地逆转这些改变，对此具有一定的治疗功能；并且VitE抑制HSC活化和增殖.VitE可能通过抑制肝脏脂质过氧化功能和由此产生的活性醛，如MDA和4羟化壬烯(4HNE)，从而抑制MDA和4HNE蛋白加合物形成，该加合物是实验性肝损伤和肝纤维化联系的枢纽［7］，进而抑制氧化应激诱导的HSCα1(I)型前型胶原基因表达和蛋白合成［8］.我们发现VitE尚不能完全逆转SOD活性，故对其剂量、疗程以及和其它药物的联合应用有待于进一步的探究.

总之，VitE可延缓血吸虫病肝纤维化进程，减轻肝纤维化程度，其机制和抗脂质过氧化功能、抑制HSC活化和增殖、降低α1(I)型前胶原基因表达和胶原合成有关，适当补充VitE进行抗纤维化治疗是一种可行的手段，有望成为一种廉价、不良反应少、疗效显著的临床用药.

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