透析中药研究与开发

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摘要：目的研究大黄中5种羟基蒽醌对金黄色葡萄球菌的抑菌作用。方法采用pH梯度萃取法从大黄中提取出蒽醌成分，采用体外实验及二分法测定各成分的抑菌效果。结果大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用，大黄酚与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌效果大黄素最好，芦荟大黄素次之，大黄酸最差。结论大黄具有抑菌作用。

关键词：大黄；金黄色葡萄球菌；二分法

现代药理研究证明，大黄具有抗菌、抗肿瘤、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、延缓衰老、调节免疫功能等作用。大黄中含有的最主要的5种羟基蒽醌是：大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。本实验主要通过对这5种羟基蒽醌的提取、分离及对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行比较，旨在为大黄在抗菌方面的应用提供一定的实验依据。

1实验材料

大黄购于沈阳中街新药特药，金黄色葡萄球菌Staphy-lococcusaureus209P购于辽宁省药品检验所。

2方法与结果

2.1大黄总蒽醌的提取[1]

称取25g的大黄粗粉，置于圆底烧瓶中，先加入50mL的20%硫酸，再加入125mL的氯仿，75℃回流4h。

2.2游离蒽醌的分离[2]

本实验采用pH梯度萃取法进行分离。氯仿总提取液50mL，加pH8的缓冲液17mL，振摇，静置，缓冲液层加盐酸酸化至pH3，静置，沉淀，抽滤得大黄酸，用冰醋酸重结晶得大黄酸精品。剩余氯仿层加pH9.9的缓冲液30.5mL，振摇，静置，缓冲液层加盐酸酸化至pH3，静置，沉淀，抽滤得大黄素，用冰醋酸重结晶得大黄素精品。剩余氯仿层加pH13的缓冲液60mL，振摇，静置，缓冲液层加盐酸酸化至pH3，静置，沉淀，抽滤得芦荟大黄素，用冰醋酸重结晶得芦荟大黄素精品。剩余氯仿层回收氯仿，得大黄酚与大黄素甲醚混合物。

2.3提取物溶液的配制

将各提取物用其相应的缓冲液配制成浓度6mg/mL的溶液。

2.4大黄中5种游离蒽醌抑菌作用的检验

2.4.1培养基的制备

牛肉浸膏0.15%，酵母浸膏0.6%，蛋白胨0.6%，葡萄糖0.1%，琼脂1.8%，pH6.9～7.1，常水配制。

2.4.2操作过程

制备50mL培养基，灭菌30min。在超净工作台上，先倒出30mL至培养皿中，再于50℃左右向另外20mL培养基中迅速加入0.6mL菌悬液，混匀，倒入同一个培养皿中。待培养基凝固后，分别点上5μL、浓度为6mg/mL的各提取物溶液。在37℃恒温培养箱中培养10h，然后进行美蓝染色。量取100mL95%乙醇，加浓盐酸1滴，即为酸性乙醇。量取100mL95%乙醇，加氢氧化钠2g，振摇，待溶解后即为碱性乙醇。取美蓝溶液20mL倒入平板中，用三角耙涂匀，2min后倾去，倒入酸性乙醇20mL，2min后倾去，倒入碱性乙醇20mL，2min后倾去。细流自来水冲洗3min，倾去并吸干浮水，快速贴上滤纸1张，用三角耙赶走气泡，10min后揭下滤纸，晾干。5种游离蒽醌抑菌圈直径：大黄酸为5mm，大黄素为9mm，芦荟大黄素为3mm，大黄酚与大黄素甲醚混合物为0mm。

2.4.3二分法测定各提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度[3]

准备16支试管，其中1支作为空白对照组，其余15支平均分成3组，分别代表3种不同的成分，每组分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号，并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配制成不同浓度的提取物溶液，向试管中加入培养基(配方与2.4.1相同，但不加琼脂)，将培养基与提取物溶液充分混合后，灭菌。最后在超净工作台上分别向3组试管中(除空白对照组)分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液。具体加入量见表1～表3。培养24h酸的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号试管全部长菌，只有Ⅰ号试管没有长菌；芦荟大黄素的情况与大黄酸一样，只有Ⅰ号试管没有长菌。大黄素的抑菌作用最好，Ⅰ、Ⅱ管都没有长菌，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号试管全部长菌表1大黄酸不同浓度溶液的抑菌作用（略）表2大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）表3芦荟大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）。

3讨论

二分法具有简便、准确、省时等特点。将待测成分按其前一个的一半浓度稀释，首先在数值计算上很方便，不用大量的计算；其次在配溶液时不容易弄乱出错，只进行稀释半倍即可；第三是在做出结果后，直接用肉眼就可以观察结果，方便快捷，无须动用其他仪器，节省时间。实验结果表明，大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用，大黄酚与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌效果大黄素最好，芦荟大黄素次之，大黄酸最差。

参考文献：

[1]张梅.中药化学基础.北京：化学工业出版社，2006.85.

[2]袁倚盛.大黄游离蒽醌的制备与纯化[J].中草药，2000，31(7)：508.

[3]郑钧镛.药品微生物学及检验技术[M].北京：人民卫生出版社，1989.149.