中药复方脑药动学研讨方式

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中药复方是中医临床用药的基本形式，研究中药复方的药代动力学规律可以阐明中药复方的组方原理与配伍规律，同时也为中药新药研究奠定基础。关于中药复方药代动力学研究，国内外学者已经提出了一些新方法和新思路，如“复方效应成分动力学”假说和“血清药理学”方法［1］。

中药复方药代动力学研究的关键问题是根据其指标成分(Markers)的体内动力学过程来反映整体的动力学规律，在选择Markers的同时，对其药效作用规律探讨也是工作的重点所在。杜力军等［2］利用PK-PD线性模型对清热复方中3种Markers与发热大鼠体温变化进行相关分析，确定了其中黄芩苷有较高的相关性，由此以黄芩苷体内动力学变化表征该清热复方的体内动力学过程;同时对活血化瘀复方中葛根素和人参皂苷Rg1与所测的药效指标间进行分析，发现葛根素和人参皂苷Rg1仅在给药后5～10min体内浓度与血小板抑制率呈正相关(r=0.999和0.996)，且符合线性效应模型(对数浓度-效应)。但葛根素和人参皂苷Rg1在体内的整个浓度变化区间与所测的药效指标之间无明显的全程相关性。分析原因，本文作者认为:一方面可能与所选的药效指标的非即时性(存在作用时间的延迟效应)有关;另一方面，也可能由于中药复方中药效物质在体内存在多途径和多靶点的协同或拮抗作用，以单一的Marker(即使是有效成分)与整体药效学指标的变化难以直接相关。为此，本文作者提出“组合血药浓度”的概念，即将Markers的血药浓度，以对药效学指标的贡献大小作为权重，进行加权组合，以“组合血药浓度”(或称“表观药效浓度”)替代单一Marker的血药浓度，进行“组合药代动力学”(combinatorialpharmacokinetics，CPK)研究，并进行CPK-PD线性模型拟合。以活血化瘀中药复方脑得生为例，以脑得生中的Markers与大鼠全血黏度(bloodviscosity，BV)、红细胞聚集指数(erythrocyteaggregationindex，EAI)和红细胞压积(hematocrit，HCT)等血液流变学特性的改变进行相关分析，探索中药复方药效物质基础及其药代动力学研究的新方法。

1仪器与材料

LCMS2010EV高效液相色谱质谱仪(日本Shimadzu公司)，LCMSsolution3.0色谱工作站(日本Shimadzu公司)，LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，ANASTAR色谱数据处理系统(美国SuntekScience公司)，微量取样器(上海求精生化试剂仪器有限公司)，XW-80A型旋涡混合器(江苏海门市麒麟医用仪器厂)，TGL-16C台式离机(上海安亭科学仪器厂)，LG-R-80F血液流变仪(北京世帝公司)，TDZ4-WS低速自动平衡离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。甲醇(色谱纯，天津康科德科技有限公司)，磷酸(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，丙酮(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)，肝素钠注射液(上海生物化学制药厂)。人参皂苷Rg1对照品(0703-200221)、人参皂苷Rb1对照品(110704-200216)、葛根素对照品(752-200108)、黄芩苷对照品(0715-9708，LC/MS内标物)(中国药品生物制品检定所)，大豆苷元对照品(美国Sigema公司)，人参皂苷Rd、三七皂苷R1(HPLC法检测纯度质量分数均＞96%)、葛根异黄酮(总黄酮含量质量分数为70%)(沈阳药科大学天然药物化学教研室)，红花黄色素A(红花黄色素含量质量分数为90%)、脑得生注射液(含红花黄色素A0.10μg•L－1、葛根素0.76μg•L－1、人参皂苷Rg10.42μg•L－1)(本实验室自制)，香兰素(HPLC-UV内标物，分析纯，沈阳市试剂厂)。健康Wistar大鼠，体质量200～220g〔沈阳药科大学动物中心，实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2003-008;实验动物使用许可证号:SYXK(辽)2003-0012〕;体质量180～220g(中国医科大学实验动物室提供)。实验期间自由饮水，大鼠静脉给药试验前禁食12h。

2方法与结果

2.1指标成分药代动力学

2.1.1色谱条件血浆中红花黄色素A与葛根素及其相关异黄酮的HPLC测定［3］.色谱柱:KromasilC18柱(250mm×4.6mm，5μm，Scienhome公司)，流动相:乙腈-体积分数为0.1%的磷酸溶液-四氢呋喃(体积比为8∶92∶2)，流速:1.0mL•min－1，检测波长:250nm。血浆中大豆苷元、人参皂苷Rg1、Rb1、Rd与三七皂苷R1的LC-MS测定［4］.色谱柱:LunalC18柱(150mm×4.6mm，5μm，Phenomenex公司)，流动相A:体积分数为0.1%的甲酸溶液，流动相B:甲醇，梯度洗脱程序:0～5min［30%(φB)～40%(φB)］、5～20min［40%(φB)～80%(φB)］，流速:0.8mL•min－1，大气压化学电离，负离子方式，选择离子监测。

2.1.2血浆样品处理方法取肝素抗凝血浆100μL，置2.0mL具塞离心试管中，加入内标溶液50μL、甲醇50μL和丙酮400μL，涡旋混合2min，离心(4000r•min－1)15min。分取上清液，于40℃氮气流下吹干。残渣加入甲醇-水(体积比为1∶1)溶液100μL，超声溶解1min，涡旋混合1min，离心(12000r•min－1)3min，取上清液10μL进样，记录色谱图，根据标准曲线计算血浆药物浓度。

2.1.3给药方案与血浆样品采集Wistar大鼠6只，以10mL•kg－1剂量尾静脉注射给予脑得生注射液，于给药前(0h)和给药后0.033、0.170、0.330、0.670、1.000、2.000、(3.000)、4.000、8.000h由眼眶后静脉丛取血约0.3mL，置于肝素化试管中，混匀，离心(10000r•min－1)5min，分离血浆，于－20℃冰箱中保存，直至分析测定。

2.1.4数据处理以待测物峰面积与内标物峰面积比值，用标准曲线计算各指标成分的血药浓度，并将各血药浓度-时间数据用3p87药动学程序进行曲线拟合。

2.1.5药代动力学结果经测定，除3''''-羟基葛根素(3''''-hydroxypuerar-in，P3)表现为类似口服给药的一级吸收过程，红花黄色素A(saffloryellowA，SyA)和葛根素(puer-arin，Pu)及其相关异黄酮大豆苷元(daidzein，Da)、大豆苷元-7，4''''-二葡萄糖苷(daidzein-7，4''''-O-glucoside，P2)、3''''-甲氧基葛根素(3''''-methoxypu-erarin，P4)、葛根素芹菜糖苷(puerarinapioside，P5)、未知物I(unknown1，U1)及代谢物I(metab-olite1，M1)在大鼠体内的药动学过程均符合二室模型;三七皂苷中，人参皂苷RbRb1，GRb1)、人参皂苷Rd(ginsenosidesRd，GRd)、人参皂苷Rg1(ginsenosidesRg1，GRg1)、三七皂苷R1(notoginsenosideR1，NGR1)等动力学过程亦符合二室模型。其中，与药效动力学过程呈正相关的大豆苷元以及葛根异黄酮代谢物M1的药-时曲线(根据文献［3－4］拟合)如图1、2所示。

2.2药效动力学文

2.2.1给药方案与血浆样品采集Wister大鼠，随机分为给药前(对照)、给药后0.5、1.0、1.5、2.5、4.0h6组，每组5只。对照组不经处置，其他各组大鼠以10mL•kg－1剂量尾静脉注射给药后，分别于不同时间心脏穿刺取血4mL，进行血液流变学测定［5］。

2.2.2血液流变学与凝血因子活力测定血液流变学的测定.取肝素抗凝血样，置血液流变仪中测定BV、HCT和EAI。

2.2.3药效学结果Markers对BV的影响.对4个切变率(200/s、30/s、5/s、1/s)下的大鼠BV均具有随时间变化的趋势，在低切变率下的BV下降幅度大于高切变率。1.0h时BV开始下降，1.5h时下降非常显著，4.0h时BV同步恢复。时-效曲线见图3。Markers对HCT的影响在0.5h时HCT开始出现下降趋势;1.5h时下降显著，作用持续至4.0h以上。时-效曲线见图4。Markers对EAI的影响对EAI的影响具有时间依赖性，其变化规律与对BV的影响基本一致。在1.0h以前呈现上升趋势，1.5h时EAI时显著下降，作用持续至2.5h，在4.0h时开始恢复。时-效曲线见图4。

2.3药代动力学与药效动力学拟合

2.3.1PK-PD拟合在药效学检测指标发生改变的时间区间内(各时间点)，将脑得生中各指标成分的血浆浓度数据(取自然对数值)与药效学指标数据进行线性拟合，相关系数(R2)和曲线斜率(k)见表1。以R2=的大小作为其相关性评价指标;k作为其贡献评价指标。Markers与BV的相关性由表1数据可见，Da对BV的下降呈正相关(R2=0.7801～0.9429);GRg1(R2=0.5941～0.8146)和NGR1(R2=0.5594～0.7390)呈负相关;其他各成分无显著相关性。Markers与EAI的相关性各指标成分与EAI的相关性和与BV的相关性一致。Da对EAI的下降呈显著正相关(R2=0.9939，r23，0.05=0.994);GRg1(R2=0.9430)和NGR1(R2=0.7305)呈负相关。Markers与HCT的相关性M1对HCT的下降呈一定的正相关(R2=0.6435);P2(R2=0.8245)、SyA(R2=0.7091)、Pu(R2=0.6957)、P5(R2=0.6781)、U1(R2=0.6780)和P4(R2=0.6547)呈负相关;P3(R2=0.5496)、GRb1(R2=0.5168)和GRd(R2=0.4899)呈一定的负相关。经PK-PD线性模型拟合，Da是大鼠BV下降(特别是BV1的下降，EAI=BV1/BV200)的主要药效物质，M1是HCT下降的主要药效物质;GRg1和NGR1对BV的下降存在拮抗作用，对HCT下降表现拮抗作用的Markers主要是SyA和葛根黄酮。

2.3.2CPK-PD拟合以药效学指标发生改变的时间区间内的PK-PD相关曲线的斜率(k)为权重，用公式(1)将不同时间点的大鼠血浆中Markers的浓度(取自然对数)进行加权组合，绘制“组合血药浓度”-时间曲线、计算“组合药代动力学”参数，并以“组合血药浓度”(ρcombinatory)与相同时间点的药效学指标的相对值(以给药前指标值为基数的比值)进行CPK-PD线性模型相关分析。lnρi=∑nj=1［kjlnρij］(1)式中，ρi为第i时间点血浆中相关Markers(包括正相关和负相关成分)的“组合血药浓度”;ρij为第i时间点血浆中第j相关Markers的浓度;kj为第j相关Markers的PK-PD相关曲线的斜率，当正相关(药理指标的变化趋势与效应一致)时，其符号不变;当负相关(药理指标的变化趋势与效应相反，如本研究中的全血黏度下降表示药理效应增强)时，其符号相反。经“组合血药浓度”计算和CPK-PD拟合，上述各项“组合血药浓度”-时间曲线与药理效应-时间曲线存在全程相关性。

3讨论

a.以其相关系数(R2)作为药效物质基础的评价指标、曲线斜率(k)作为其对药效贡献大小(包括协同与拮抗作用)的评价指标是可行的。与BV和EAI相关的“组合血药浓度”-时间曲线见图5-7;与HCT相关的“组合血药浓度”-时间曲线见图8;Da血浆浓度与BV的全程PK-PD相关曲线见图9(n=5，R2=0.0013～0.0365)，“组合血药浓度”与BV的全程CPK-PD相关曲线见图10(n=5，R2=0.7969～0.9085);Da、M1血浆浓度与EAI、HCT的全程PK-PD相关曲线见图11(n=5，R2=0.1380和0.1165)，“组合血药浓度”的CPK-PD相关曲线见图12(n=5，R2=0.8170和0.7948)。3讨论a.中药复方“脑得生”中的指标成分Da是引起大鼠BV和EAI下降的主要药效物质基础，而GRg1和NGR1对该药理指标具有拮抗作用。由表1可见，在大鼠BV发生改变的时间段(1.5～4.0h)内，Da与BV下降存在相关性(R2=0.7801～0.9429，r23，0.05=0.993)，但无全程(0.5～4.0h)相关性(见图9，R2=0.0013～0.0365，r25，0.05=0.771)。说明:在0.5～1.5h区间，虽然Da血浆浓度较高，但由于GRg1和NGR1的抑制作用，使“组合血药浓度”处于低水平状态(图5-7)，因而不能产生应有的药理作用。同理，M1是大鼠HCT下降的主要药效物质，但进行全程PK-PD相关分析时，却表现出负相关(对HCT下降有抑制作用)。在0.5～1.5h时段内M1浓度虽然处于高水平下降阶段，但因受到葛根黄酮的强烈抑制作用(且该抑制作用随其浓度的下降而逐渐减弱)，表现为“组合血药浓度”处于低水平、并逐渐升高的变化趋势(图8)，该变化趋势与HCT的变化趋势一致，故而在CPK-PD拟合中表现出显著的全程相关性(见图12，R2=0.7948，r25，0.05=0.771)。b.CPK-PD相关分析中，以PK-PD相关曲线的相关系数(R2PK-PD)的大小为秩序，以CPK-PD相关曲线的相关系数(R2CPK-PD)为指标，可确定中药复方中对该药理指标具有协同或拮抗作用的药效成分，或无该药理作用的无关成分。通过对多个不同的药理指标的相关分析，可阐明中药复方多途径、多靶点作用的药效物质基础及其配伍规律。c.进行CPK-PD相关分析与PK-PD相关分析时，均应首先确定该药理指标的药效响应是否存在作用时间的延迟效应。若存在时间滞后，在进行相关分析时，应引入时间差，即将“组合血药浓度”与药理指标变化进行时间错位匹配。d.若对所监测的指标成分(Markers)经CPK-PD相关分析，不能获得较高的相关系数。说明，所选择的Markers可能并非该复方中对该药理指标的药效物质(群)。其原因可能是药理指标选择不恰当，或起药效作用的物质基础并非复方中Markers的原形结构。正如本文中，大鼠HCT下降的主要药效物质并非脑得生中的原形物质，而是葛根黄酮的活性代谢物M1，其结构有待进一步确证。