眼络通冲剂研究论文

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1仪器与试药

1.1仪器日本岛津LC10ATvp高效液相色谱仪、SPD10Av紫外检测器；7725i手动进样阀（20μl定量管），10μl微量注射器；HS色谱数据工作站V4.0+（杭州英谱）；CQ250超声波清洗器。

1.2试剂与药材葛根、川芎、三棱等药材，βCD（上海伯奥生物科技有限公司），葛根素对照品（供含量测定用）、川芎对照药材均由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为752200801和091820007；薄层层析硅胶G（浙江雁荡山试剂厂），甲醇（色谱纯），正己烷、乙酸乙酯、乙醚及石油醚均为分析纯，水为蒸馏水。

2方法与结果

2.1眼络通冲剂的制备将处方量饮片打成粗粒，混合均匀，加10倍水量，按审批标准制剂工艺水煎煮法提取2次，第1次1.5h，第2次1h，提取液合并，静置，取上清液，浓缩至比重1.25以上的浸膏。加入人工麝香、少量糊精及矫味剂，混合均匀，用70%乙醇适量制软材，过10目筛制粒，50℃低温烘干，分装，规格为15g/袋。如上制作三批，批号分别为：080310、080320、080401。

2.2川芎定性鉴别

2.2.1供试品溶液的制备取本品细粉4g，加无水乙醇5ml，摇匀，再加入乙醚30ml，加热回流1h，放冷，滤过，取滤液挥干，加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺川芎的阴性对照样品4g，同法制成阴性对照溶液。

2.2.2对照药材溶液的制备取川芎对照药材1g，加乙醚30ml，加热回流1h，同法制成对照药材溶液。

2.2.3薄层层析板的涂铺取硅胶G3.5g，置研钵中，加水12ml，研磨均匀，铺板10×20cm2薄板一块，晾干，于110℃烘箱中活化30min，置干燥器中备用。

2.2.4薄层色谱法照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录）试验，吸取上述3种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（9：1）为展开剂，展开12cm，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，结果供试品色谱图中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的亮蓝色荧光斑点，Rf=0.40，阴性样品无此斑点。

2.3三棱定性鉴别

2.3.1供试品溶液的制备取本品细粉4g，加无水乙醇5ml，摇匀，再加入乙醚30ml，50℃水浴加热回流1h，放冷，滤过，取滤液置40℃水浴上浓缩至约2ml，作为供试品溶液。另取缺三棱的阴性对照样品4g，同法制成阴性对照溶液。

2.3.2对照药材溶液的制备取三棱对照药材2g，加乙醚30ml，加热回流1h，同法制成对照药材溶液。

2.3.3薄层层析板的涂铺取硅胶G3.5g，置研钵中，加0.6%羧甲基纤维素钠溶液12ml，研磨均匀，铺板10×20cm2薄板一块，晾干，于110℃烘箱中活化30min，置干燥器中备用。

2.3.4薄层色谱法照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录）试验，吸取对照药材溶液5μl，供试品溶液与阴性对照溶液各10μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯（17∶3）为展开剂，展开12cm，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，结果供试品色谱图中，在与对照药材色谱相对应的位置上，显相同颜色的亮蓝色荧光斑点，Rf=0.45，阴性对照样品无此斑点。

2.4葛根素含量测定

2.4.1色谱条件与系统适用性试验以Kromasil100-5C18（4.6mm×250mm，5μm）为色谱柱；甲醇-水（30：70）为流动相；流速1ml/min；检测波长为250nm；进样量为5μl，柱温为室温。在此条件下，样品色谱图中葛根素与其他相关峰均能达到基线分离，保留时间为16.4min，葛根素峰理论板数应不低于3000，与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。阴性样品色谱图表明，处方中其他几味中药对测定无干扰。

2.4.2对照品纯度检查取每1ml含葛根素1.29mg的70%甲醇溶液，进样10μl，在本实验条件下，未见杂质峰，按面积归一法计算纯度为100%。

2.4.3线性关系精密称取经60℃减压干燥至恒重的葛根素对照品12.98mg，置10ml量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分置10ml量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，按本文给定的色谱条件，各进样5μl，测定峰面积，以峰面积积分值Y与对照品进样量X（μg）进行线性回归，回归方程为

Y=4.526×106X+5.464×104r=0.9999

结果表明：葛根素进样量在0.06～0.65μg范围内与峰面积具有良好的线性关系。因此，在线性范围内可采用外标一点法定量。

2.4.4精密度和重复性试验取同一对照品溶液，重复进样5次，求得葛根素峰面积的RSD为0.77%。另称取同一批号（080310）样品5份，每份约0.5g，分别按“2.4.9”项下方法制备样品溶液进样测定含量，求得含量的RSD为0.51%（n=5）。

2.4.5稳定性试验取供试品溶液1份，在0、2、8、24、48h分别按“2.4.9”项下方法进样测定含量，结果表明在48h内供试品溶液是稳定的。

2.4.6日内和日间精密度取同一份对照品溶液，在日内每隔2h取样测定1次，连续5次，求得峰面积的RSD为0.85%（n=5）；另取同一批号样品，每天取样按“2.4.9”项下方法测定含量，连续测定5d，求得含量的RSD为0.48%（n=5）。

2.4.7提取条件选择

2.4.7.1提取溶剂选择文献报道［12］多用甲醇水提取样品中葛根素，故考察不同浓度甲醇对提取的影响，称取样品5份，每份0.5g，置100ml量瓶中，分别加50%、60%、70%、80%甲醇约150ml，超声处理30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，根据测定结果，确定用70%甲醇作溶剂。

2.4.7.2溶剂体积选择精密称取本品3份，每份0.5g，置200ml量瓶中，分别加70%甲醇80、120、180ml，摇匀，超声溶解30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，根据测定结果，本法确定加入溶剂体积约120ml。

2.4.7.3提取时间的选择精密称取本品5份，每份2.0g，置200ml量瓶中，各加入70%甲醇约180ml，分别超声溶解10、20、30、40、50min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，结果表明，超声处理30min含量已不再增加，故确定超声时间为30min。

2.4.8加样回收率测定精密称取已知含量样品9份，每份0.25g，置50ml量瓶中，分别精密加入葛根素对照品溶液（取12.44mg+70%甲醇→20ml）1，2，3ml（0.622，1.244，1.866mg），再各加入70%甲醇至40ml，超声溶解30min，按“2.4.9”项下方法进样测定含量，计算回收率，得高、中、低3个浓度平均加样回收率分别为101.2%、101.1%、101.4%，RSD分别为1.1%、0.94%、0.41%（n=3）。

2.4.9样品测定取本品约20g,研细,再精密称取细粉约0.5g，置200ml量瓶中，加70%甲醇120ml，超声溶解30min，放冷，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取葛根素对照品用70%甲醇配制成浓度约为60μg/ml的对照品溶液,各进样5μl，记录色谱图，按外标法计算葛根素含量，结果见表1。

表1眼络通颗粒样品测定结果（略）

3讨论

本制剂处方中川芎、三棱两味中药均含有挥发油，按标准制剂工艺采用水煎煮提取、再浓缩制粒方法，其中的挥发油成分损失较大，影响疗效，且自拟质量标准中制定的川芎挥发油定性鉴别为将样品溶液直接点样于滤纸上，置紫外光灯（365nm）下观察，显亮蓝色荧光。经检测发现，该方法受到样品中相关组分干扰，荧光斑点不明显，缺乏专属性。因此参照中国药典（2005版）一部建立了川芎挥发油的薄层色谱鉴别方法，展开剂采用正己烷-乙酸乙酯（9∶1）可获得满意结果。参照文献［3］建立了三棱挥发油的薄层色谱鉴别方法，展开剂采用石油醚-乙酸乙酯（17：3）可获得满意结果。

经试验发现，用不同溶剂提取葛根，在反相色谱柱上可得到不同的色谱图，主要表现在水煎煮提取葛根时，在色谱图上可分离到葛根素峰两个相关组分峰，葛根素峰与相关峰之间分离度良好。本文针对用醇提取葛根工艺制备的样品，建立的色谱条件能较好地分离样品中葛根素与相关组分峰，适用样品中葛根素的分离测定。三批样品测定结果表明，葛根素含量在5.90～6.78mg/g之间，考虑到不同来源葛根其葛根素含量差异较大，暂定本品葛根素含量限度应不低于4.5mg/g。

【参考文献】

［1］黄亚非.采用高效液相色谱法测定心脉通口服液中葛根素的含量［J］.中国中药杂志，2001，26（11）：760.

［2］向大雄.离子对色谱法测定心脑安颗粒剂中葛根素含量［J］.中国医院药学杂志，2002，22（5）：261.

［3］伍月红.三棱与莪术的比较鉴别［J］.广东药学，1994，4（4）：25.

【摘要】［目的］研究眼络通冲剂的定性和定量质控指标。［方法］采用硅胶G薄层色谱法对冲剂中两种主要成分川芎和三棱进行定性鉴别；用RPHPLC法对葛根素进行含量测定，采用Kromasil1005C18（4.6mm×250mm，5μm）为色谱柱，甲醇-水（30:70）作流动相，检测波长为250nm。［结果］葛根素进样量在0.06～0.65μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系，相关系数r=0.9999，日内、日间精密度RSD分别为0.85%和0.48%（n=5）。得高、中、低3个浓度平均加样回收率（n=3）分别为101.2%、101.1%、101.4%，RSD分别为1.1%、0.94%、0.41%。［结论］硅胶G薄层色谱定性法和RP-HPLC定量法结果准确可靠，重现性好，可作为该制剂质控标准。

【关键词】反相高效液相色谱法；薄层色谱法；葛根素；川芎；三棱；眼络通冲剂