自动化分析方法研究论文

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摘要:血清胆固醇的增高，尤其是lDL-C的增高，可显蓍增加冠心病（coronaryarterydiseaseCAD）的危险性，本文就lDL-C的自动化测定方法进行综述。

关于lDL-C的测定方法，目前常用的有聚乙烯硫酸盐化学沉淀法（pVS法）[1]、肝素柠檬酸纳化学沉淀法（hCS法）[2]和friedewald公式计算法（f公式法）[3]，另外还有nCEP推荐的参考方法即超速离心─化学沉淀法（bQ法）和琼脂糖电泳染色法[5]。上述方法中，选择性沉淀法需预先沉淀分离，其中pVS法在tG＞4g/L时，结果明显偏低，hCS法的准确性依赖于精确的pH（5.11）,F公式法在tG＞4g／l时，估算值准确性差，且需要总胆固醇、tG和hDL-C的准确测定值，影响因素较多[6]，而超速离心─化学沉淀法（bQ法）和琼脂糖电泳染色法既麻烦又费时，不适合临床实验室。近年来随着自动化分析仪的日益普及，研制开发适用于自动化分析的lDL-C直接（direct）测定法已是当务之急，本文就lDL-C的自动化分析方法的研究进展作一综述。

1免疫分离法

1995年mcnamarajR等[7]利用sigma公司提供的由genzyme公司发明的directLDLTM试剂盒直接测定血清中的lDL-C，该法是通过使用包被有高亲和力的羊抗人apoAI和apoE多克隆抗体的聚笨乙烯胶乳，用一种特制的具有离心过滤装置的双层试管，当一定量的血清和已包被有抗体的聚苯乙烯胶乳悬液被加入到双层离心试管中，使apoAI和apoE抗体与血清中的cM、vLDL、lDL和hDL发生作用，然后1500g离心5min,免疫沉淀的cM、vLDL、iDL和hDL被过滤装置截留在内层小试管内，含有lDL的滤液被外层试管回收，通过酶法测定滤液中胆固醇的浓度，即可得出lDL-C的含量，mcnamaraJR等对该法的研究结果表明：分别用本法（y）和超速离心法（x）测定115例禁食、非禁食脂代谢异常的患者血清标本，(TG≤35.85g/L)，两种方法相关性良好，y＝0.8x+0.182,r=0.97,n=115。本法批内cV为1.2%～3.8%，批间cV为2.0%～5.1%。用本法可以测定随机非禁食标本和中高度tG水平标本，且准确度能达到cDC所要求的lDL-C准确度≤±5%的标准，表明免疫分离法是一种简便准确的lDL-C直接测定方法，但该法仅适用于新鲜血清标本，冰冻标本随冰冻时间的延长而产生逐步增加的负偏差。1997年，maitraa等[8]对lDL-C直接测定法（d-LDL）也进行了较系统的研究，他们对156名正常人和高tG患者(TG0.65～9.95g/L)，分别用l-LDL、d-LDL和参考方法bQ-LDL超速离心─化学沉淀法，三种方法进行lDL-C水平的测定，其中d-LDL法即免疫分离法（试剂盒由sigma公司提供），l-LDL法是由poly-medco提出的一种选择性化学沉淀法。结果表明：以国际公认金标准bQ-LDL法为参考方法，在tG＜4g/L时，三种方法间呈现良好的相关：l-LDL=1.1BQ+0.03，r=0.95，x=1.32mmol/L，y=1.46mmol/L，sy/x=0.14，n=106；dLDL=0.98BQ-0.01，r=0.97，x=1.32mmol/L，y=1.29mmol/L，sy/x=0.1，n=106；在 tG≥4g／l时，三种方法同样相关良好：l-LDL=0.97BQ+0.37，r=0.91，x=1.23mmol/L，y=1.56mmol/L，sy/x=0.18，n=50；l-LDL和dLDL法对bQ-LDL法的平均偏差分别为12.7%和6.2%(TG＜4g/L）、30.6%和12.5%(TG＞4g/L)。三种方法在测定禁食和非禁食标本时，结果无显著差别，于1995年jialali等[9]的研究结果相近。提示：dLDL法比l-LDL法更具有优越性,是常规测定lDL-C的较好的方法，该法也适用于高脂血症儿童标本的分析[10]。

2比浊法

1983年，burtl等[11]设计的固定时间动态化学比浊快速测定法，用肝素、ca2+、eDTA特异性地沉淀lDL而产生浊度，以脂肪酶法去除vLDL干扰。该法主要是测定lDL总体颗粒而不是lDL-C，但可用已知lDL-C值的参考血清的浊度计算出标本中lDL-C的浓度，其结果同f公式间接计算法或lRC超速离心法相关良好。1997年岳秀玲[12]报道利用免疫比浊法测定血清中lDL-C，其测定原理是血清中lDL抗原与试剂中羊抗人lDL抗体作用，形成抗原抗体复合物，并产生浊度，该浊度的高低在过量抗体存在时，与抗原（lDL）的含量成正比，同时，由于反应液中含有稳定剂可使非ag-Ab复合物（如脂类、大分子蛋白多聚物等）消浊，而消除非特异性干扰，用已知lDL-C值的参考血清的浊度计算出待测标本中lDL-C的浓度。结果表明：本法批内cV＝2.6％，批间cV＝5.5％，与pVS选择性沉淀法比较两法相关良好，r=0.86。但本法结果(X=3.97mmol/L)较pVS法(4.33mmol/L)明显偏低，p＜0.05。试法简便、快速，既适用于手工操作，更适合于全自动生化分析仪。但kerscher等[13]指出测定完整的lDL颗粒还不能像lDL-C那样做为一个明确参数，以lDL颗粒的量估计lDL-C可能受到lDL颗粒中胆固醇含量个体差异的影响。

3选择性测定法

日本第一化学药品株试会社(Daiichi)推出lDL-C直接测定试剂盒，该试剂盒为液体双试剂盒，适用于各类自动生化分析仪，在无需标本预处理的情况下，实现lDL-C自动化分析。该法原理[14]是试剂1中的表面活性剂可使样品中的hDL、vLDL和cM颗粒解离，胆固醇分子被释放出来，立即同胆固醇酶试剂反应，产生的h­2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时lDL颗粒仍是完整的，加入试剂2（含另一种表面活性剂和偶联剂），它可使lDL颗粒解离释放出胆固醇，在胆固醇酶试剂的作用下，产生h2O2，参与trinder反应而显色,色泽的深浅与lDL-C的含量成正比，通过与相应的标准品（lDL-C的校正物）比较，计算出样品中lDL-C的含量。本法的分析不精密度＜5％，符合nCEP的要求[4]，因简便、快速、准确，适用于自动化分析，是一种很有发展前途的lDL-C直接测定法。

小结：上述三种方法中，免疫分离法尽管称为直接测定法，但仍需将血清用连接有抗体的聚苯乙烯胶乳免疫分离预处理过程，且本试剂价格昂贵，免疫比浊法，简便、快速、成本低，适用于自动化生化分析仪。选择性测定法简便快速、微量准确，可适用于具有双试剂加样功能的各类自动化分析仪，是比较理想的lDL-C自动生化分析方法，但目前尚无国产试剂，由于进口试剂价格昂贵，限制了本法在国内的广泛应用。

参考文献

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2Wiellandh,SeidelD.JLipidRes,1983;24:904-909

3FriedewaldwT,Levu,RI,FredricksonDS.ClinChem,1972;18:499-502

4BachoricpS,RossJW,ClinChem,1995;41:1414-1420

5Marzw,SiekmelerR,ScharnaglHetal,ClinChem,1993;39:2276-2281

6Schectmang,PatschesM,SasseEA.ClinChem,1996;42:732

7McnmarajR,ColeTG,ContoisJH,etal,ClinChem,1995;41:232-240

8Maitraa,HiranySV,JialalI,ClinChem,1997;43:1040-1047

9Jialali,Hirany,SV,DevarajS,etal,AmJClinpathol,1995;104:76-81

10Harrisn,Neufeld,EJ,NewburgerJW,etal,ChinChem,1996;42:1182-1188

11DemackerpN,HijmansAG,BreminkmeijerBJ,etal,ClinChem,1984;30:1797-1800

12岳秀玲，杜洪涛，吴希云。陕西医学检验，1997；12（2）：11

13Kerscherl,SchieferS,DraegerB,etal,ClinBiochem,1995;18:118-225

14日本第一化学药品株式会社说明书