蚊虫基因组数据分析论文

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1蚊虫的基因组学研究

蚊虫基因组序列的揭示为其基因的克隆鉴定和功能分析提供了很好的平台。由于蚊基因组中高度重复序列的广泛存在，给一些基因特别是非编码序列的分子克隆带来了困难，而基因组序列的提供给这一问题的解决带来了福音。利用已获得的白纹伊蚊基因组序列，我们已顺利克隆了其嗅觉结合蛋白（OBP）和嗅觉受体（OR）基因及其调控序列，为其嗅觉发生分子机制的阐明奠定了基础。Criscione等通过比较斯氏按蚊雌蚊和雄蚊的基因组DNA和RNA样本的Illumina测序结果，发现了一个Y染色体特有的基因GUY1。Hall等则发明了一种更为有效的染色体熵法，该方法的优势是仅利用高通量测序获得的基因组和转录组数据，而不需要一个固定在染色体上的参考基因组来进行比对。通过比对两种疟疾重要传播媒介斯氏按蚊和冈比亚按蚊的高通量基因组和转录组数据，系统性地在斯氏按蚊和冈比亚按蚊中各发现了3个Y基因。同时通过对鉴定的Y基因进行生物进化分析，结果表明按蚊的Y染色体进化迅速。随后，Hall等又使用染色体熵的方法比对了雄性和雌性埃及伊蚊基因组DNA和RNA的Illumina测序数据，筛选并鉴定了一个新的基因myo-sex。myo-sex基因几乎只存在于雄蚊的基因组，但是由于基因重组偶尔地能在雌蚊的基因组中发现，具有雄性偏好性，是一个可能具有性别拮抗效应的肌球蛋白重链基因。蚊虫基因组数据也为蚊虫性别决定网络底部基因dsx的研究提供了依据。dsx是性别决定网络中的调控核心，主要行使决定体细胞和生殖细胞性别的功能，也可调控中枢神经相关基因fruitless，进而调节性行为。冈比亚按蚊基因组数据之后，Scali等率先鉴定了冈比亚按蚊dsx的性别特异性转录本，其横跨2号染色体85kb的区域，通过选择性拼接产生多个外显子组成的雌性和雄性特异性转录本。而随着2014年斯氏按蚊基因组的，有研究者将Scali等报导的Angdsx与刚的斯氏按蚊基因组和转录组进行序列比对，发现一致性达到了97%，而与冈比亚按蚊基因组及转录组序列一致性仅为85%。Scali等在埃及伊蚊中发现了两种雌性特异性的可变剪接方式，这不同于黑腹果蝇和冈比亚按蚊具有的特异性DsxF。

2蚊虫的转录组学研究

转录组学（transcriptomics）是一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。传统上用于转录组数据获得和分析的方法主要有基于杂交技术的芯片技术包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，但目前使用最普遍的是RNA-seq即转录组测序技术。基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。巨蚊属是蚊科中三种不吸血的蚊属之一，其幼虫阶段以同在小型水体中孳生的白纹伊蚊和埃及伊蚊为食，两性成蚊均不吸血，以植物汁液和花蜜为食。为了探究巨蚊与其它吸血蚊种在搜寻宿主方面的基因水平上有何差异，国外有学者从巨蚊上分离出触须、触角和身体其他部分，分别提取这三部分的RNA，利用RNA-seq技术，将获得的序列片段从头组装，与目前已公布的致倦库蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊基因组数据进行系统进化树分析，发现巨蚊与埃及伊蚊的种属关系最近，并且在上述四种蚊种中均发现了编码气味分子受体（odorantreceptor,OR）蛋白和离子转移受体（ionotropicreceptor,IR）蛋白的基因，但值得注意的是，巨蚊受体蛋白的表达量与丰度上较其它蚊种都有所降低［18］。因为这些受体蛋白被认为与吸血昆虫搜寻宿主气味分子如CO2有关，所以，巨蚊在长期的生物进化过程中，丧失了原本存在的吸血习性。蚊唾液腺蛋白与其吸血传病密切相关。国外有学者提取白纹伊蚊雌性成蚊的唾液腺RNA后进行转录组和蛋白质组分析，发现至少有32个基因在雌性成蚊的唾液腺中表达程度或者增高或者降低，另外有17个基因表达在雌性成蚊唾液腺和雄性成蚊中，但不表达在雌性成蚊的其他组织中。通过分析发现，其中大约三分之一的基因功能表现在吸血、消化糖、免疫应答等方面，但是并未发现其余基因的明确功能，所以非常有可能是长期吸血的过程中进化出的新的功能分子。利用同样的方法，分析冈比亚按蚊、斯氏按蚊、达氏按蚊、埃及伊蚊、白纹伊蚊、致倦库蚊和致死按蚊（Anophelesfunestus）的唾液蛋白相关的转录组，可以将这些蛋白归纳为：

（1）昆虫唾液腺中普遍存在的唾液蛋白，包括抗原-5蛋白家族、核酸酶、碳水化合物水解酶等；

（2）在吸血的长角亚目昆虫（包括白蛉、蚋、蠓等）中丰富表达的D7蛋白；

（3）仅在蚊唾液腺中存在的蛋白，包括30000左右的过敏原蛋白家族（allergenfamily）和一些粘蛋白。很多昆虫都被发现具有一种独特的生物学现象——滞育（diapause）。昆虫的滞育现象被认为是一种休眠的形式，在昆虫发育时遇到不适宜的环境时，就会马上由体内激素调节并控制，暂时停止发育。白纹伊蚊被发现同样具有滞育现象，这是它能适应环境气候变化，实现快速扩张入侵的生物学基础之一。白纹伊蚊的雌性成蚊在每日受到较短时间的光照后，产下的卵不会立即孵化，这便是一种滞育的现象。有趣的是，同是伊蚊属的埃及伊蚊，其雌性成蚊产的卵如果没有接触到水，也不会孵化、发育，这却被认为是一种静息状态（quiescence）。这两种现象的区别在于，发生滞育后，白纹伊蚊的卵即使收到合适的外界环境的刺激，仍需要经过一段时间的恢复才会孵化，而处于静息状态的埃及伊蚊的卵，只要受到适宜条件的刺激（如接触到水），就会马上进入发育阶段。国外有学者利用RNA-seq技术，对这两种现象进行分析，发现这两种现象在发育停止的阶段，分子水平上是很相近的，不同之处在于滞育现象的早期准备阶段和后期修复阶段，是其所独有的。关于滞育现象的早期准备阶段，国外学者通过RNA-seq技术，比较滞育前阶段（pre-diapause）的白纹伊蚊胚胎与同时期非滞育的白纹伊蚊胚胎基因表达水平上的差异，发现前者在基因表达模式上有非常大的改变。目前，已有学者归纳和总结出了一套利用RNA-seq技术研究白纹伊蚊滞育现象的方法，为今后更全面、彻底地认识白纹伊蚊以及其他媒介昆虫的滞育现象提供了坚实的基础。利用RNA-seq技术，我们对白纹伊蚊不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雄蚊、雌蚊）和感染登革病毒前后的转录组进行了分析。对比分析不同发育阶段特别是雌雄蚊的基因表达谱，我们找到了在胚胎早期对性别分化具有重要作用的候选基因和对雌蚊吸血传病相关的性别偏爱基因。对比分析登革病毒感染与否的白纹伊蚊转录组，我们发现了可能与蚊媒与病原相互作用有关的免疫分子（未发表结果）。目前，针对这些候选基因的进一步功能分析正在进行之中。另外，对白纹伊蚊抗药品系和敏感品系的RNA-seq对比分析也在进行中，这对于其抗药机制的阐明非常重要。

3蚊虫的小RNA组学研究

小RNA（smallRNAs）主要指长度在18~30nt的一类非编码RNA（ncRNAs），在真核生物中，具有基因表达调控功能的小RNA主要有微小RNA（microRNAs,miRNAs）、内源小干扰RNA（endo-siRNAs）和piwi干扰RNA（piRNAs）。piRNA长度集中在26-31nt,目前只在动物的生殖系细胞及干细胞中被发现，其主要功能是参与转座子的沉默。miRNAs和endo-siRNAs长度主要集中在20~24nt。miRNAs在动植物和微生物中都普遍存在，据估计一个物种中约1/3的基因会受到miRNA的调控，大量的实验也表明miRNAs参与了诸多生命过程的调控，例如细胞周期、细胞分化、组织器官的发生、营养代谢、信号途径以及对外界生物的非生物的环境的反应；同时，miRNAs在生产实践与临床治疗上也具有很大的应用前景。以往用于寻找miRNAs等小RNA的方法有实验克隆法、计算机预测法。克隆法可以直接用于鉴定新小RNA，是初期发掘小RNA的常用方法，不足之处是实验周期较长，对低表达的小RNA的发现能力十分有限。计算机预测法多是针对某一已知的小RNA特征设计算法，从全基因组或EST数据库中快速发掘大量潜在的小RNA，一定程度上弥补了克隆法的缺点，然而，预测的小RNA最终还需要实验证明，同时计算机预测法对新类型小RNA的发掘能力十分有限。随着第二代高通量测序技术的问世，小RNA高通量测序（smallRNA-Seq）技术开始逐渐取代原始的小RNA发掘法方法，该法具有速度快、成本低、覆盖度深等多方面的优点，对鉴定与发现生命体内的小分子RNA及其功能与机理研究起极大的推动作用。全世界有超过3000种蚊虫，目前为止仅有冈比亚按蚊、斯氏按蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊以及白纹伊蚊鉴定出miRNA。一些miRNA的文库和功能分析表明miRNA对蚊虫的卵巢发育和吸血后的血液消化具有调节作用。病毒感染可以对宿主细胞miRNA的表达水平产生深远影响，可能与宿主抗病毒机制及病毒入侵后改变细胞内环境有关，雌蚊中miRNA的表达模式会随着病原体的感染而发生变化。Hussain等对登革病毒（DENV）编码的miRNA或病毒小RNA（vsRNAs）的进行了功能研究，他们发现6个vsRNAs能通过作用于病毒基因组RNA茎环结构中的5''''和3''''的UTR区，显著增加病毒复制。中肠屏障是蚊虫防止病原体入侵而建立的重要屏障，Alexander等的研究发现miR-1174仅在伊蚊和按蚊的中肠中表达，且雌蚊吸血后其表达量明显上调；而当miR-1174表达下调后，蚊子吸血率明显降低，寿命明显缩短。作者认为：蚊特异性miRNAs，特别是miR-1174具有重要的生物学意义，它们可能影响人们今后控制蚊虫的策略。我们对白纹伊蚊不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雄蚊、雌蚊、吸血后雌蚊）的小RNA进行了深度测序分析。结果在白纹伊蚊中筛选出119条已知的miRNA基因，确定了15条novelmiRNA基因，其中11条是伊蚊特异的，并且观察到许多miRNA呈现期特异表达的特点。经过实验验证，miR-286、miR-2492和miR-1891分别在白纹伊蚊的卵、幼虫和成虫期特异高效表达，敲低/敲除这些miRNA会对蚊虫的生长发育造成显著影响。这些研究为新型生物杀虫剂的研发提供了靶标。我们还对感染登革病毒前后白纹伊蚊的细胞和成虫的小RNA进行了深度测序分析。结果在感染登革病毒的白纹伊蚊中找到了10条表达上调的miRNA和11条表达下调的miRNA。通过对这些差显表达miRNA的功能分析，发现miR-252通过与E蛋白3''''-UTR区域的结合，对登革病毒的复制起到抑制作用；而miR-281则通过与E蛋白5''''-UTR区域的结合，对登革病毒的复制具有促进作用。这些研究为抗登革病毒药物的设计和研发提供了线索。piRNA来源于转座元件、基因间隔区和一些编码蛋白质基因的3''''UTRs，对维持基因的完整性和稳定性有一定作用，但最近的研究证明它在抗病毒免疫中也有较大作用。Schnettler等的研究证明：对蚊虫细胞感染虫媒病毒可以引发piRNA路径，而敲除piRNA蛋白质会使病毒产生增多。Castellano等确定了多个24-30nt的Piwi相互作用RNAs基因组簇，通过比对到转座元件和蛋白质编码基因的3''''UTRs，发现许多TEs和一些内源性基因的3''''UTR产生大量具有piRNA样特征的29-nt小RNAs峰。此外，来自冈比亚按蚊和黑腹果蝇TEs的正义和反义piRNAs揭示了piRNA序列偏差的新特征。弗吉尼亚理工大学的研究人员最近在库蚊中发现了一种新型的抗病毒途径，Morazzani等在无dicer-2和无突变的蚊细胞中进行的实验表明，病毒产生的piRNA样小RNA可以在病毒产生siRNA的过程中调节病毒感染的发生。同时也表明新的piRNA途径存在于蚊媒的体细胞中并且可能发挥着比siRNA途径更宽泛的的抗病毒作用，显示出其为强大的免疫系统。因此，理解病毒如何绕开蚊虫的双重抗病毒反应对于科学家来说是越来越有趣的挑战。

4结语

随着新型测序技术和生物信息学分析技术的不断发展，生物医学研究也迎来了大数据分析时代。近年蚊虫组学的快速发展，给其媒介生物学、入侵扩散的机制研究等提供了广阔的、深远的大数据分析平台，也必将为蚊虫的媒介控制和传播疾病的防制带来更多的机遇和指引。

作者:吴恙谢李华刘培文李小聪闫桂云陈晓光单位:南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系