多元统计分析法评价杞菊地黄丸探讨

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摘要目的：建立杞菊地黄丸的HPLC指纹图谱，为评价其质量提供依据。方法：色谱柱：InertsilODS⁃3（4．6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈⁃0．3％磷酸溶液，梯度洗脱；体积流量：0．6ml·min－1；检测波长：254nm；柱温：40℃；进样量：10μl。建立杞菊地黄丸的指纹图谱，根据相似度评价，结合化学计量学方法对杞菊地黄丸进行质量评价。结果：建立25批杞菊地黄丸的HPLC指纹图谱，共确定26个共有指纹峰，通过与对照品比对指认了8个成分；25批样品指纹图谱相似度为0．731～0．981，通过聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法⁃判别分析（PLS⁃DA），25批样品分成4类，分类结果与厂家呈相关性，并发现16个差异性标记物。结论：所建立的HPLC指纹图谱方法重复性好、专属性强，可为杞菊地黄丸的质量控制提供依据和参考。

关键词：杞菊地黄丸；高效液相指纹图谱；相似度评价；聚类分析；主成分分析；偏最小二乘法⁃判别分析

杞菊地黄丸由枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻等八味中药组成，现收载于中国药典2020年版一部，可用于治疗肝肾不足、阴虚阳浮、头晕耳鸣、羞明流泪、视物昏花等症状［1］。临床应用方面主要用于治疗高血压、高血脂、干眼症、慢性结肠炎、早期老年黄斑变性、脑震荡后遗症等［2～5］。目前关于杞菊地黄丸的质量标准研究更多地是关于莫诺苷、马钱苷和丹皮酚的含量测定［6～8］，其他成分研究报道较少。中药复方制剂是多成分协同发挥治疗作用，仅检测单一或几个成分含量不能充分、全面、客观的评价其内在质量。中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与含量，进而对药品质量进行整体描述和评价，可应用于质量一致性评价、真伪鉴别等方面。指纹图谱即可定性鉴别使用，还可体现量的大小，包含的信息量大且多维［9，10］。为了快速、全面的解析数据，指纹图谱数据分析常结合聚类分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判别分析等化学模式识别技术进行［11］。本研究建立杞菊地黄丸的HPLC指纹图谱并进行相似度评价，同时结合化学模式识别方法对谱图进行全面分析，为全面评价杞菊地黄丸质量提供依据。

1仪器与试药

Waterse2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；CPA225D电子天平（德国赛多利斯公司）；El⁃masonicP超声波清洗仪（德国Elma公司）；水浴锅（天津泰斯特）莫诺苷对照品（批号：111998⁃201602，含量以96．3％计）、马钱苷对照品（批号：111640⁃201707，含量以99．2％计）、丹皮酚对照品（批号：110708⁃201407，含量以100％计）、绿原酸对照品（批号：110753⁃201716，含量以99．3％计）、木犀草苷对照品（批号：111720⁃201408，含量以94．9％计）、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸对照品（批号：111782⁃201706，含量以97．3％计）、木犀草素（批号：111520⁃200504）对照品购自中国食品药品检定研究院；4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸（批号：E⁃0451⁃19010531，含量以98．0％计）购自上海同田生物技术股份有限公司；甲醇、乙腈、磷酸均为色谱纯，液相用水为超纯水。杞菊地黄丸（大蜜丸）来源于10个厂家共25批样品，编号S1～S12（A厂家，批号：15010253、16012264、16013102、16013106、16013107、16013311、16013313、16013314、17010773、17010774、17010779、17010781）；编号S13（B厂家，批号：1710007）；编号S14～S16（C厂家，批号：161101、170401、171101）；编号S17（D厂家，批号：20161101）；编号S18～S20（E厂家，批号：5480072、5480074、5480075）；编号S21（F厂家，批号：115495）；编号S22（G厂家，批号：1704026）；编号S23（H厂家，批号：1606116）；编号S24（I厂家，批号：A17008）；编号S25（J厂家，批号：11170926）。

2方法与结果

2．1色谱条件

色谱柱：InertsilODS⁃3（4．6×250mm，5μm）；流动相：乙腈（A）⁃0．3％磷酸溶液（B）梯度洗脱（0～100min，1％→35％A）；流速：0．6ml·min－1；检测波长：254nm；柱温：40℃；进样量10μl。

2．2溶液的制备

2．2．1对照品溶液精密称取莫诺苷、马钱苷、丹皮酚、绿原酸、木犀草苷、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸、4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素各对照品适量，加70％的甲醇制成浓度分别为238．63，131．82，385．13，19．82，13．68，88．32，9．36，20．51μg·ml－1的对照品混合溶液作为对照品溶液。2．2．2供试品溶液取剪碎的大蜜丸约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇25ml，密封，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，既得。2．2．3单味药材供试品溶液按照样品处方和工艺，分别取适量枸杞子、菊花、熟地黄、酒萸肉、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻，按“2．2．2”项下供试品溶液制备方法制备单味药材溶液。

2．3方法学考察

2．3．1精密度试验取杞菊地黄丸供试品（编号：S9）按“2．2．2”项下方法制备供试品溶液，在“2．1”色谱条件下连续测定6次，记录色谱图。结果，以马钱苷峰为参照峰，26个共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD为分别小于0．13％和2．6％（n＝6），将6次采集的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统（2012．1版本）”，以精密度1为参照图谱，6次采集的图谱与生成的对照图谱相似度均大于0．992，表明仪器精密度良好。2．3．2重复性试验取杞菊地黄丸供试品（编号：S9）按“2．2．2”项下方法制备供试品溶液6份，在“2．1”色谱条件进行测定，记录色谱图。结果，以马钱苷峰为参照峰，26个共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD为分别小于0．18％和3．5％（n＝6），将6次采集的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统（2012．1版本）”，以重复性1为参照图谱，6次采集的图谱与生成的对照图谱相似度均为1，表明该方法重复性良好。2．3．3稳定性试验取“2．3．1”项下供试品溶液，在“2．1”色谱条件下于0，2，8，12，24h进样测定，结果，以马钱苷峰为参照峰，26个共有峰相对保留时间及相对峰面积RSD为分别小于0．58％和3．3％（n＝5），将5次采集的色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统（2012．1版本）”，以稳定性0h色谱图为参照图谱，4次采集的图谱与生成的对照图谱相似度均大于0．995，表明溶液在24h内稳定性良好。

2．4共有峰的归属及化学成分的指认取

“2．2”项下对照品溶液、供试品溶液、单味药材供试品溶液，按“2．1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图1～图3，由对照图谱共指认8个特征峰，分别为峰5莫诺苷、峰7绿原酸、峰9马钱苷、峰15木犀草苷、峰173，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸、峰184，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸、峰23木犀草素、峰26丹皮酚。由单味药材色谱图比对可知，峰1，2，5，8，9，10归属酒萸肉；峰2，3归属熟地黄；峰1，4，6，8，11，13，15，16，24，26归属牡丹皮；峰7，8，12，14，15，17，18，19，20，21，22，23，24归属菊花；峰25归属山药。

2．5指纹图谱的建立及相似度的评价

［12］分别取25批供试品，按“2．3”项下方法制备供试品溶液，在“2．1”色谱条件进行测定，记录色谱图。采用“中药指纹图谱相似度评价系统（2012．1版本）”，以S1号样品的色谱图为参照图谱，时间窗宽度0．2min、中位数法、多点校正、全谱峰匹配，共标定26个共有峰；计算相似度，得到25批样品及对照指纹图谱的叠加图及相似度结果，见图4和表1。25批样品相似度结果为0．731～0．981，其中S13、S17、S22、S24相似度较差，均低于0．90；其他厂家多个批次相似度结果在0．922～0．981之间，相似度较好。

2．6化学模式识别分析

［13］2．6．1聚类分析（clusteranalysis，CA）以25批杞菊地黄丸的26个共有峰面积为变量，将数据导入SPSS26．0软件，采用组间连接，平方欧式距离进行聚类分析。由图5可知，类间距离为5时25批样品分为4类，S13（B厂家）一类、S17（D厂家）一类、S24（I厂家）一类、其他厂家一类。聚类趋势表明大部分厂家批次的样品质量趋于一致，但个别厂家样品有差异性。2．6．2主成分分析（principalcomponentanalysiPCA）将25批样品的26个共有峰面积数据导入Simca⁃P14．1软件，以26个共有峰面积值作为变量，进行主成分分析，观察样品的自然聚集，PCA得分图见图6。由图6可看出，S13、S17、S22、S24样品与其他样品分散，其他厂家样品聚集性明显，这一结果与相似度评价及聚类分析结果一致。2．6．3偏最小二乘法⁃判别分析（discriminantanalsisofpartialleastsquares，PLS⁃DA）CA和PCA分析仅能对样品进行分类，无法分析25批样品间存在差异的原因，为分析引起组间差异的差异标志物，本实验将25批样品共有峰面积值导入Simca⁃P14．1软件，通过PLS⁃DA分析生成变量重要性投影值图（VIP图），VIP可直观体现各化合物引起组间差异的权重大小，化合物VIP值大于1说明对样品分类结果权重影响率大于50％，即对分类结果影响具有统计学意义，为差异标志物［10～14］。通过PLS⁃DA分析，得到差异标志物（VIP＞1）共16个，分别为峰8、13、6、17、3、7、24、16、2、10、1、4、18、26、12、21。涉及了能检出成分的四个单味药材。

3讨论

3．1供试品溶液制备方法摸索

本试验对比了不同的提取溶剂（50％甲醇、50％乙醇、70％甲醇、75％乙醇、95％乙醇、纯甲醇）、提取方法（超声提取、加热回流提取）、提取时间（30，45，60，75min）对杞菊地黄丸色谱峰数量及响应值的影响。最终确定制备方法为75％乙醇醇加热回流提取1h。

3．2流动相选择及优化

本试验对比了不同种类的流动相，首先对比了乙腈、甲醇与酸液，甲醇分析时间长且峰型和分离度较差，因此有机相选择了乙腈。后又对比了不同浓度的乙腈⁃磷酸、乙腈⁃冰醋酸溶液、不同的洗脱程序和不同的流速结果乙腈⁃0．3％磷酸溶液，梯度洗脱色谱峰数量多，峰型和分离度较好。因此最终确定，以乙腈⁃0．3％磷酸溶液为流动相，梯度洗脱。

3．3检测波长的选择

本试验采用了全波长扫描测定了杞菊地黄丸样品，结果在254nm下供试品溶液色谱峰信息丰富，色谱峰分离度较好，因此采用254nm作为杞菊地黄丸指纹图谱的检测波长。

3．4结果分析

本研究共分析了10个厂家25批样品，25批样品相似度结果为0．731～0．981，其中S13（B厂家）、S17（D厂家）、S24（I厂家）、S22（G厂家）四个厂家样品相似度小于0．90；S1～S12（A厂家）相似度结果为0．942～0．981，S14～S16（C厂家）相似度结果为0．922～0．978、S18～S20（E厂家）相似度结果为0．934～0．974。由相似度结果看出，同一厂家相似度结果较好，且大部分厂家样品相似度结果差别不大，个别厂家差异较大。通过聚类分析、主成分分析结果可以看出S13、S17、S22、S24与其他样品差异较大，这与相似度评价结果一致。为了找出差异标志物，对25批样品进行了PLS⁃DA分析，找出影响样品组间差异标志物16个，这16个成分涉及酒萸肉、熟地黄、菊花、牡丹皮，说明其质量差异影响因素与处方中各单位药材均相关。

3．5小结

本研究建立了25批杞菊地黄丸HPLC指纹图谱，进行了相似度评价，25批样品的相似度为0．731～0．981。确定了26个共有指纹峰，结合化学对照品指认出8个化合物，分别为莫诺苷、绿原酸、马钱苷、木犀草苷、3，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸、4，5⁃O⁃二咖啡酰基奎宁酸、木犀草素、丹皮酚；并对25批样品进行了聚类分析、主成分分析及偏最小二乘法⁃判别分析，找出了差异样品4批和差异标志物16个。该方法简单、专属性强，可为杞菊地黄丸质量控制提供参考。

作者：王小芳 郑倩倩 路丽娟 单位：石家庄市食品药品检验中心