浅谈3R原则及实验设计

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摘要：3r原则（即替代，减少，优化）广泛适用于实验教学和任何科研领域的动物实验中。成功应用3R的关键是在收集数据之前，需要提前考虑好合理的实验设计和分析方法。很多实验设计原则，比如实验设计要有效、可靠和高效；实验结果的统计方法要清晰透明；在实验室确保对动物福利的尊重和理解，都是有助于实现3R原则目标的关键。

关键词：3R原则；实验设计；应用

3R原则适用范围很广，比如基础医学的实验教学，科学研究，或是兽医学，最直接的就是实验室的动物实验。然而目前，3R原则是否可以成功应用于实验室，仍然是一个不容乐观的问题。十年前欧盟每年用于研究和药物检测的实验动物大约1200万只，美国每年至少1700～2200万只[1]。而最近几年每年全球实验动物使用量预计至少在一亿以上。然而，这还仅仅是保守估计，因为很难准确统计出所有用于实验的动物数量，大部分国家不会将相关数据公布出来。从现有的数据可以清楚地看到，在过去几十年里，用于科学研究的实验动物数量有增无减。合理应用3R原则可以有效解决这个问题，因此，3R原则及其在实验中的应用和推广至关重要。

13R原则

3R原则是1959年英国动物学家WilliamRussell和微生物学家RexBurch在经典著作《仁慈试验技术原理》提出的[2]。3R原则中的“R”分别是replacement（替代），reduction（减少），refinement（优化）。作为实验动物伦理法则，应用于任何与动物实验相关的科学研究、实验教学及其他领域中。旨在倡导研究者在工作中用其他实验方法或实验材料取代实验动物，通过合理的实验设计把实验动物的使用量降到最低，改善或者降低实验动物承受的痛苦。第一个“R”，replacement（替代），分为绝对替代和相对替代。绝对替代是最理想的结果，比如通过计算机建立虚拟模型来替代活体动物和动物来源的细胞、组织、器官，完全取代实验动物。而相对替代，则是指使用动物来源的，已经建立好的细胞系，或者用低疼痛感的模式动物（单细胞动物）替代哺乳动物。第二个“R”，reduction（减少），指在不影响实验数据的“质”和“量”的前提下，尽可能减少实验动物的使用量，提高实验动物的利用率和实验的精确度。“减少”不单是指在原有的实验上减少使用实验动物的数量，除此之外，还有一层“相反”的含义，就是增加单个小实验的动物使用量，所获得的实验结果可以有效减少整个实验设计所需的动物数总量。最后，第三个“R”，refinement（优化），指通过任何途径来避免或减少实验动物现有的或潜在的精神紧张、痛苦和不良反应，提高实验动物福利。Russell和Burch把对动物的伤害分为必然伤害和偶然伤害。必然伤害是指实验设计带给实验动物的伤害，偶然伤害则是由于操作不当对实验动物造成的意外伤害。

23R在实验设计中的应用

无论是教学还是科研，3R原则在实验设计部分的应用至关重要，因为实验设计与分析方法从根本上决定了实验动物的“最少”使用量和实验动物承受的“最低”痛苦。“最少”和“最低”是指在理想状态下，没有因实验操作不当造成实验动物意外的死亡和不必要的伤害。实验设计的目的，通常是验证假设，一般我们可以通过检测某个特异性指标来验证假设。无论是通过何种方法验证假设，3R原则都应该始终贯穿其中，即与实验设计和分析紧密相连，尽量用模式动物替代哺乳动物，或者在实验教学中，用模拟实验替代动物实验；减少对实验结果价值很少甚至没有价值的实验动物的使用，避免不必要的浪费；优化实验方法，以避免或减少实验动物的痛苦，精神紧张和伤害的时间，以改善实验动物福利[3]。如何在保证实验结果的前提下，遵循3R原则，在实验设计阶段，把实验动物使用量降到最低，把实验动物承受的痛苦降到最低，是每一个研究者在设计研究方案期间必须思考的问题。2.1减少实验中所需要的动物数量。2.1.1判断适当的样本大小。理想情况下，如果不考虑伦理，资金，时间，人力物力或其他方面的成本，研究人员希望通过检测全部目标人群来揭示事物的本质或者真理。显然，在绝大多数情况下，这既不可能也不可取，因此，研究人员必须在保证研究结论具有一定可靠性的前提下，估算最少的样本量。不能少于“必要的数量”，也不能过多。这个数字无论过多还是过少，对实验结论和实验动物都是不负责的表现。理论上，“必要的数量”（样本量）取决于实验设计，统计的变量类型（连续型变量，分类型变量等）。检验水准、检验功效、总体标准差、容许误差都是决定样本含量的要素。实验设计和分析方法越复杂，精密度准确度要求越高，需要估计的未知变量越多，样本就越大，计算也越复杂。2.1.2采用高效的设计方案。为了增加实验的检验功效，研究者可以增加样本量，减少现有实验的变异，采用替代措施，在解答相同研究假设的基础上，获得更大的（标准化）效应量。比如应用区组化设计消除个体变异对实验结果的影响，或者在嵌套设计中，采用因素组合而不是一次测试一个因素，这样可以从相同数量的动物中收集更多信息，并且每个因素组合可以设计有相对较少数量的动物。2.2使用其他手段替代动物实验。在实验设计中应用绝对替代，必须保证获得的数据与其所替代的基于动物实验所获得的一样可靠、有效。如果失去这个前提，特别是在医学模型设计或者毒理学试验中，就变得没有意义了。关于相对替代，英国1986年制定的《动物（科学方案）法令》（《实验动物法》）对动物物种以及物种的发育阶段进行分级，作为实验设计中相对替代的选择原则。替代方案合理性的评估指标是相关性和可靠性。相关性相当于预测效度，而可靠性是指实验的重现性。2.3优化现有实验，减少动物受到的痛苦和伤害。Russell和Burch把“优化”分为两种，一种是针对由实验设计本身给实验动物带来的痛苦，一种是针对由于疏忽大意给实验动物带来的意外伤害。第一种一般是建立模拟人类某种疾病的动物模型，这种情况，我们应该尽可能在设计实验时，降低由疾病造成的实验动物痛苦的时间，减轻伤害的程度。比如，美国动物伦理委员会规定，荷瘤小鼠的肿瘤最大直径不能超过2cm，违反动物伦理要求，再有贡献的研究数据也会被撤销，甚至研究结论也会遭到质疑。2015年，一篇4年前发表于《Nature》的文章引起了争议，原因就是研究人员使小鼠肿瘤体积超过了规定大小。最后文章虽然没有被撤稿，但有关小鼠的实验数据被撤销。除此之外，实验动物在过程中的恐惧和痛苦，会对实验结果进行干扰，增加实验的变异性/偏差[4]。优化实验设计，注重实验动物福利，不仅是伦理要求，也是对实验结果的一种负责。

3结语

动物实验广泛存在于基础研究（教学），临床药物研究以及兽医研究中。每年为此贡献出生命的实验动物数量相当庞大。一项科学研究，想要得出客观理性的结论，必须有扎实的统计数据做保证，设计不佳的实验和不充分的统计分析，会造成实验动物不必要的损失，违背实验动物伦理学的3R原则。想要在实验中成功应用3R原则，关键在于收集数据前反复思考的实验设计和统计方法。而3R原则的应用也可以起到改进实验研究的目的。比如，合理、可靠、高效的实验方案；清晰、明确的观察指标；实验中对实验动物福利的重视。将实验动物的使用减到最少，对实验动物的伤害降到最低，是我们一直需要努力的方向。

参考文献

[1]PeterSinger.动物研究中的伦理学问题[J].中国医学伦理学，2004，17（2）：31-34，36．

[2]RussellWMS，BurchRL．ThePrinciplesofHumaneExperimentalTechnique[M].London：Methuen，1959．

[3]白晶.动物实验3R原则的伦理论证[J].中国医学伦理学，2007，20（5）：48-50．

[4]杨青.国内外医学实验动物福利现状与思考[J].天津医学，2011，23（4）：74-76．

作者:苑博 单位:天津医科大学基础医学院