水产养殖多菌种混合培养分析

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摘要:研究多菌种功能微生物混合培养的条件优化，主要采取正交实验方法，从培养基配方、pH、温度、菌种接种等方面，研究各功能菌良好生长的混合培养条件。

关键词:水产养殖；菌种；混合培养

使用微生态制剂整治养殖生存环境，成本低且没有抗药性以及药物遗留等问题，因此成为21世纪养殖业的未来走向。当前，光合细菌、肠球菌等一些单一菌剂和复合菌是我国水产养殖中较为常用的菌剂。但从当前常用到的水产养殖菌剂来说，出现了多菌种菌剂种类少、菌剂耐盐性能不理想等问题。单一菌剂限制了水产养殖水体的生物修复作用，因此在实践应用过程中采用有一定耐盐性能的多菌种制剂非常具有实践性[1-3]。本文主要研究混合培养的条件与它们之间的生长关系。

1材料方法

1.1材料。1.1.1试验材料在次试验过程中选取的菌种有：英膜红假单胞菌（Rspcapsulata）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）和假丝酵母菌（Candida）。1.1.2试剂Na2HP04•12H20、KH2P04、MgSO4•7H20、NaCl、NaOH、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚；蛋白胨、酵母粉、牛肉膏39、琼脂粉、蒸馏水；结晶紫液、95%的乙醇、0.5%的番红水溶液；PER引物、PER常规操作使用试剂和酶均购自TaKaRa公司。1.1.3仪器SPX智能生化培养箱，SW-CJ-IF超净工作台，YXQ-LS-75SII立式电热压力灭菌锅，ZHWY211B回转式摇床，eppendoff5417R高速离心机，578BR0349PCR扩增仪，UnitedGK-3300凝胶成像系统，CHZOBIMF200光学显微镜，V1TEK-32梅里埃微生物全自动鉴定仪，UV-2550紫外分光光度仪等。1.2方法。1.2.1三种功能菌的接种时间前后将地衣芽孢杆菌、假丝酵母菌与荚膜红假单胞菌通过不同的接种时间前后融合到接种于光合细菌基础培养基中，设置30℃、100r•min-1摇床下培养后利用分析其细胞生长数量筛查出3种功能菌混合培养的比较理想的接种时间前后顺序。1.2.2三种功能菌混合培养的培养基优化在光合细菌基础培养基条件下，分析不同碳源、氮源和无机盐对3种功能菌混合培养的影响，在此期间利用因素轮换法进行。3种功能菌的最佳培养基方案是采用正交实验进行筛查。1.2.3三种功能菌混合培养的条件优化利用正交实验法，根据最佳培养基方案分析各种温度、pH、溶氧等环境状态下3种功能菌混合培养受到的影响，进而提出最优混合培养的理想条件。1.2.4三种功能菌混合培养的生长关系检测3种功能菌通过混合培养以及纯培养状态下细胞生长数量，对其中2种培养条件中的细胞对数生长期时的繁殖代数（n）、生长速率常数（R）与世代时间（G）的区别，进而建立3种功能菌混合培养的生长关系。1.2.5生长量测定利用平板菌落计数法。在光合细菌培养基中对英膜红假单胞菌进行培养，在营养琼脂培养基中对衣芽孢杆菌进行培养，假丝酵母菌利用酵母菌培养基进行培养。1.2.6计算公式繁殖代数(n)=3.322(lgx2-1gx1)；生长速率常数(R)=n/(t2-t1)；世代时间(G)=1/R。式中，t1、t2为菌种进人对数生长期初期与末期的培养时间；x1、x2为菌种进人对数生长期初期与末期的细胞数量。

2结果与分析

2.1各类培养基对功能菌株生长的影响。实验过程中，以光合细菌培养基作为对3种功能菌在培养过程中的伊始基，这也是为了研究由光合细菌为主的复合型微生态制剂。利用测定地衣芽孢杆菌在细菌肉汤培养基和光合细菌基础培养基和假丝酵母菌在酵母菌培养液和光合细菌基础培养基中的细胞生长量，进而掌握每个菌种中营养所需的重要区分。实验结果表明，地衣芽孢杆菌以上两种培养基中的生长状态大致相同，都是以最快的速度生长，同时到9h实现最高生长数量；而假丝酵母菌在各种培养基状态中的生长区别较为明显：处于酵母菌培养基过程中进入到生长过程中非常快，同进在24h后处于最大生长量（1.41×l09CFU•mL-1），当放到光合细菌基础培养基时，通过12h之后菌体渐入到生长过程中，同时48h之后才达到最大生长量（4.7×107CFU•mL-1）。由此表明，假丝酵母菌和地衣芽孢杆菌相比下，地衣芽孢杆菌更适合在光合细菌基础培养基中生长。2.2.3种功能菌混合培养的微生态关系地衣芽孢杆菌、假丝酵母菌与荚膜红假单胞菌3种菌体间没有拮抗关系。利用3种菌混合培养和自身纯种培养的长征特点分析了将3种菌混合到一起进行培养，试验结果显示：地衣芽孢杆菌和另外两株功能菌之间并不存在共栖关系，假丝酵母菌与荚膜红假单胞菌之间有利于对方生长的作用。这是由于在进行混合培养过程中，英膜红假单胞菌生长所需要的营养假丝酵母菌为其提供了小分子产物，反之英膜红假单胞菌代谢也为其提供了生长所需的营养成分。对3种功能菌进行混合培养过程中，其细胞生长数量分别是3%～4%，明显低于各纯种培养过程中的接种量10%，3种功能菌的生长量荚膜红假单胞菌生长量接近于纯培养数值，另外两种功能菌生长量不佳，呈现下降趋势。由此可以看出，3种菌种之间对于一些物体可能有着竞争关系存在，也不排除是因为培养基pH的因素所致。2.3不同的接种时间前后对三种功能菌混合培养的影响。在此次实验中分别设置3个实验组：实验1，在光合细菌的培养基中将3种菌株一起放入培养基中；实验2，在光合细菌基础培养基中先对荚膜红假单胞菌与假丝酵母菌进行培养到48h时时再放入地衣芽孢杆菌；实验3，先将荚膜红假单胞菌培养到24h和48h时，再将假丝酵母菌以及地衣芽孢杆菌分别连接。在试验过程中实时检测以上3种功能菌各个接种顺序下的细胞生长速度，检测结果如图1、图2、图3所示。实验2的接种前后时间，3种功能菌在培养过程中都生长优良，同时培养时间到60h时都到达到了生长数量的最高值；但是使用实验1的接种前后时间，地衣芽孢杆菌通过混合培养过程后，还没有到72h时就已经进到了死亡过程，菌体大面积死亡；根据接种前后时间，假丝酵母菌在实验3中的生长状态不佳。生长曲线由图3所示，夹膜红假单胞菌在进行培养之后由于生长速度几乎处于零，因为致使培养基中的pH呈快速上升状态直到出现偏碱性，由于假丝酵母适合在偏酸性状态下生存，因此阻碍了假丝酵母菌的生长。

参考文献：

[1]谢航.水产养殖功能微生物的筛选与多菌种混合培养条件的研究[D].福州:福州大学,2005.

[2]尹苗.益生性微生物饲料添加剂的研究[D].济南:山东师范大学,2000.

[3]张欣宇.复合益生菌微生态添加剂的培养条件优化及功效评价[D].长春:吉林大学,2015.

作者:孙争荣 单位:凌海市达莲海珍品养殖有限责任公司