线粒体分子标记技术下的水产养殖论文

导语：线粒体分子标记技术下的水产养殖论文一文来源于网友上传，不代表本站观点，若需要原创文章可咨询客服老师，欢迎参考。

1D-loop区

线粒体DNA非编码区由两个tRNA基因分离，D-loop区域就处在这个非编码区中[2]。在线粒体DNA中，D-loop区是重链和轻链的复制起点，也称之为“控制区ControlRegion”，其进化压力较小，是线粒体DNA基因组序列和长度变异最大的区域，Horai等[3]发现该区域的基因变化速度比细胞核DNA和其他细胞器的基因快5倍，同时也是进化最快的部分。因此，选择D-loop区作为鉴定种群遗传状况的分子标记直接有效。利用D-loop的序列在群体遗传学上进行分析的工作在20世纪70年代就已经展开了，那时候仅仅用于分析区域内种间的亲缘关系。现今，D-loop区已经广泛被用作非常高效的工具来推断不同区域内种间或种内的亲缘关系和遗传状况。D-loop区中仍然细分为3个部分，中央保守区、终止序列区和保守序列区。其中终止序列区包含了线粒体DNA终止复制的相关序列，是变异最大的部分[4]，最具研究和分析价值。在进行数据结果分析时，由D-loop序列分析得到的单倍型多样性指数和核苷酸多样性是两个评价群体遗传资源或者群遗传多样性的重要指标。

1.1野生群体遗传多样性分析

1.1.1D-loop部分序列分析D-loop序列分析中，由于并不是整个D-loop序列都发生碱基的插入或者替换，可以采取对保守序列区或者终止序列区的部分区域进行扩增。由于这两个部分的进化比中央保守区迅速得多，只对这一区段的序列进行分析也能代表物种的遗传多样性和进化过程。张仁意等[5]对青海4个不同湖水采集的155尾裸鲤（Gymnocyprisprzewalskii）个体的线粒体DNA的D-loop区中部分序列进行扩增，得到754bp的序列长度，分析发现155个样本中有34个单倍型，但4个群体中可鲁克湖群体的单倍型多样性和核苷酸多样性远低于其他种群；进一步的遗传分化系数的分析表明，该地区已经产生一定的遗传分化，但由于地理隔离的原因，系统发育树结果还没有发展出明显的单枝，加之该区域群体的遗传多样性偏低，需要进行重点保护。

郑真真等[6]对全球大青鲨（Prionaceglauca）进行了D-loop区中694bp扩增分析，采集了来自中东太平洋、中西太平洋、中东大西洋、西南大西洋和印度洋5个海域的165尾个体，分析发现145个单倍型，变异程度非常大。进一步分析后发现5个区域的大青鲨种群的单倍型和核苷酸都处于较高水平，种质资源较好；但是遗传分化指数显示5个区域存在强烈的基因交流，种群遗传分化水平较低。邹芝英等[7]采集了8尾长鳍鲤（Cyprinuscarpiovar.longfin），扩增得到600bp的部分序列，找到了与终止区域相关的6个特征序列；对这些特定的区域分析得到6个单倍型，13个变异位点，显示了较好的种质资源状况，核苷酸多样性数值与其他鱼类接近，遗传状况中等，由于该物种稀有且仅存在偏远地区，保护珍惜水产动物资源已经迫在眉睫。向燕等[8]为了了解3种鲟鱼：达氏鲟（Acipenserdabryanus）、中华鲟（A.sinensi）和史氏鲟（A.schrencki）亲鱼的遗传状况和遗传背景，对线粒体D-loop区部分序列进行分析，扩增得到400bp的序列，49尾亲鱼个体一共得到仅18个单倍型，并且对于单倍型系统发育树分析后，发现集中在6个单倍型中，说明这些群体很有可能来自同一母亲；不过各单倍型遗传距离较远，说明父本来自不同的个体；其结果提示，在生产中仍要采用不同单倍型进行人工繁育，以避免近亲而导致种质退化。

Kumazawa等[9]研究发现，D-loop的5＇端和3＇端有串联重复序列，这段的变异速率较快。Abinash等[10]在北美不同区域采集淡水扁头鲶（Pylodictisolivaris），对35bp的串联重复区进行分析检测，从美国35个水系采集了330尾样本，分析结果发现，在东南墨西哥湾的70%样本出现串联重复的变异，而采自密西西比河95％的样本和墨西哥湾西南沿岸的扁头鲶没有出现这个区域的变异；系统发育的计算结果表明，在70万年和205万年左右出现群体分流；从地理位置上看，密西西比河的支流进入墨西哥湾西南沿岸流域，而东南墨西哥湾为另一条流域；该结果表明种群的遗传结构受到地域特殊性的影响。D-loop区部分序列的结果分析能满足一定程度的遗传多样性和遗传状况分析，可以得到可靠的结果数据帮助人们进行资源保护和简单的育种工作。随着科技进步和测序水平的改善，进行全序列的测序渐渐进入研究者的视野，全长序列将获得更加完整和正确的结果。

1.1.2D-loop全序列分析D-loop的多态性一种是来源于碱基的突变、插入和替换形成的不同单倍型，不仅种间有差异，种内个体间也存在差异，只是重复的差异小于种间的差异。而且在个体中D-loop一旦发生差异，线粒体DNA会稳定地将这种差异遗传下去，这种差异在个体间表现为线粒体DNA分子的长度变异，因此对D-loop全长进行分析研究更能体现整体的变异程度。肖明松等[11]在淮河淮滨段、凤台段、蚌埠段、洪泽湖段采集84尾野生乌鳢（Ophicephalusargus）进行种群资源的研究，分析发现33个单倍型，检测了单倍型多样性（h）、核苷酸多样性（Pi）、遗传分化指数（Fst）、遗传距离以及中性检验、错配分析和NJ树，发现其h和Pi较高，表明种群平均多态性相对较好；但在遗传距离的分析中发现所有群体的差异都较小，这可能是由于在淮河流域中不同支流的种群交流程度较高造成的，所以变异发生在种内，而种群之间的分化较少。董志国等[12]对大连、东营、连云港、舟山、湛江和漳州6个地区的野生三疣梭子蟹（Portunustritubercatus）进行D-loop全基因组区的遗传多样性及群体遗传结构的分析，选择单倍型多样性和核苷酸多样性作为重要指标，并加入了群体遗传分化指数的分析，进行Tajima’sD中性检验和单倍型间的分子变异分析，发现不同地区梭子蟹的遗传多样性很高，产生一定的遗传分化；不过在系统发育关系分析中，地理距离对遗传距离没有显著的关系，原因仍需要进一步研究。赵良杰等[13]在千岛湖汾口、富文、临岐3个大眼华鳊（Sinibramamacrops）主要繁殖区域采集了115尾个体，对样品进行了形态学和D-loop序列测定后，分析形态主成分和各个基因遗传学分析指标，发现千岛湖各地的大眼华鳊之间有丰富的基因交流，并没有形成容易灭绝的小种群，表明各个地理群体仍然有丰富的遗传多样性，面对一定的灾害时有一定的弹性，不过这样的良好状况仍然需要政府和渔民对该区域的种质资源进行保护。高志远等[14]对海南松涛水库南丰镇、番加乡、白沙群体的长臀鮠（Cranoglanisbouderius）的D-loop序列全场进行分析，44尾个体中发现11个单倍型，但在分析中发现单倍型较高，而核苷酸多样性较低，认为是由于海南岛偏僻的地理位置难与大陆长臀鮠进行基因交流，推断在历史中可能出现过严重的瓶颈效应；中性检测也表明没有任何整体或局部的种群扩张，数据皆表明该地域长臀鮠正处在较危险的境地，需要进行种群的保护措施。

1.2养殖群体遗传多样性分析目前，国内对水产动物养殖过程中出现的生长不良与病害频繁大多归结于饲料与环境的问题。诚然，营养和免疫是养殖的关键，但是由于人工育种和繁育杂交造成的种质资源下降也是重要因素之一。养殖户往往在育种过程中，没有考虑到育种群体的遗传状况，导致近亲杂交，子代产生各种问题。徐钢春等[15]对灌江纳苗养殖刀鲚（Coilianasus）的子三代品种与在淡水生活环境下湖鲚（C.nasustaihuensis）两个群体的遗传多样性进行了比较和分析，进行单倍型和核苷酸分析后，发现养殖刀鲚的遗传多样性要优于湖鲚，这可能是由于刀鲚仅是子三代，还未经历大量的人工繁殖和育种，保留了较好的遗传状况；而湖鲚由于其陆封型的特点，导致其种质资源渐渐下降，需要进行放流等活动保证种质资源。姚茜等[16]对来自浙江湖州某公司的养殖群体、缅甸引进的群体和两者杂交的“南太湖1号”群体的罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergii）的D-loop区进行分析，共16尾群体分析得到14个单倍型，结果表明缅甸引进的群体核苷酸多样性最高，浙江湖州人工养殖群体的多样性最低，说明人工育种对遗传多样性有较大的影响。通过遗传距离和遗传分化指数分析发现，杂交群体更加偏向本地种群。在今后的育种工作中，可在杂交代中选取优秀性状的沼虾，与缅甸种群杂交，以获得更优秀的品种，为今后的人工繁育打下基础。李胜杰等[17]将珠江水产研究所养殖品种大口黑鲈（Micropterussalmoides）与北方和佛罗里达两个野生群体进行D-loop区的遗传分析，在23尾采集的样品中，5尾个体含有两种单倍型，北方11尾个体发现9种单倍型，而佛罗里达仅有1种单倍型。在遗传距离分析上发现，珠江水产研究所的养殖群体与北方群体更加接近。对于单倍型多样性和核苷酸多样性分析，结果表明养殖群体与国外种群相比，其遗传多样性处于较低水平，需要开展种质的保护工作，应引入国外品种进行杂交，改善国内养殖群体的遗传结构，提高遗传多样性，丰富大口黑鲈的种质资源。

1.3亲缘与起源分析D-loop区串联重复的现象虽然丰富，但是不同动物的重复位置不一致，重复的序列和重复的单元也不一致，所以相近物种之间对比分析有助于明确不同物种的关系。郝君等[18]对乌克兰鳞鲤（Cyprinuscarpio）、鲫（Carassisauratus）、鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）、鳙（Aristichthysnobilis）、草鱼（Ctenopharyngodonidellus）和乌苏里拟鲿（Pseudobagrusussuriensis）6种不同鱼的线粒体D-loop区进行测序，分析了种内、种间遗传结构差异，发现作为分子标记对系统分化效果的差异，6种不同鱼的碱基含量、碱基差异、遗传距离和系统发育都有显著的差异，构建的D-loop序列的NJ系统树展示了6种鱼的分类地位，肯定了D-loop区比邻近区段的tRNA和12sRNA在鱼类识别、分类、种类鉴定和遗传多样性分析上更加可靠。侯新远等[19]对5种虾虎鱼类进行了系统进化关系的研究，分析了河川沙塘鳢（Odontobutispotamophila）、鸭绿沙塘鳢（O.yaluensis）、中华沙塘鳢（O.sinensis）、葛氏鲈塘鳢（Perccottusglenii）及尖头塘鳢（Eleotrisoxycephala）这6种虾虎鱼类同源长度约为830bp的D-loop序列，通过系统发育树和遗传距离分析，得到6种鱼类的亲缘关系即河川沙塘鳢、鸭绿沙塘鳢、中华沙塘鳢、平头沙塘鳢聚为一支，尖头塘鳢、葛氏鲈塘鳢和褐塘鳢等聚为另一支，为鱼类资源的分类和利用提供了基础。马波等[20]在额尔齐斯河采集了两种类型的银鲫（C.auratusgibelio），对几种鲫鱼的可量性状和D-loop区进行分析，得到了优势种群的生长性状，确定了它们的遗传学特征和分类学地位，同时通过D-loop区的单倍型共享率研究了两种鲫的起源和遗传特征，这些结果对我国将来进行银鲫育种有很大帮助。Klaus等[21]利用D-loop序列对欧洲鲤鱼（C.carpio）137的起源进行研究。在此之前对于欧洲鲤鱼也有过很多关于起源的研究：Zhou等[22]发现一些欧洲养殖的鲤鱼起源可能在德国和欧洲，而俄罗斯主要养殖的鲤鱼起源在亚洲。Zhou等[23]在德国镜鲤和伏尔加河的野生鲫鱼利用D-loop区全序列获得独特的3种单倍型；而Mabuchi等[24]在日本鲤鱼中发现有两个D-loop区单倍型与Zhou等报道的欧洲发现的单倍型非常相似。Klaus等[21]的研究结果指出欧洲和中亚所有的鲤鱼品种有一个共同的祖先，而且有可能是在后冰河时期传播到中亚或者欧洲。对于这种现象，可能是由于在育种过程中，没有进行规范的养殖记录，导致各种群出现杂交现象。而且，养殖户挑选具有优势性状的品种进行交配，容易导致其他稀有单倍型的消失，从而使得种质资源慢慢下降。

1.4个体内异质性分析同一个体内存在多种重复序列数目不同从而表现为异质。高祥刚等[25]采用克隆技术，在我国海域随机采集了3头斑海豹（Phocalargha），每尾个体任选14个克隆菌，对它们的线粒体DNAD-loop区的终止序列区进行扩增测序，发现其个体内存在多种不同的串联重复单位，即存在异质现象，说明我国的斑海豹种质资源保护较好，进化状态比较积极。张四明等[26]在野生的中华鲟种群种间和个体体内检测线粒体DNA的长度变异情况，发现中华鲟有较多个体的异质性，表现出良好的遗传多样性。由此可见，个体的异质存在是导致线粒体DNA中控制区D-loop长度变化的主要原因，而个体的线粒体DNA长度异质性是直接推动动物物种遗传多样性的重要途径。综上所述，可以发现线粒体D-loop区的序列分析已经在水产行业取得大量进展，D-loop区基因的插入、突变和替换都是影响多样性的关键，而个体内的异质和串联重复的高频率变化不仅存在于水产动物个体中，也存在于种群内，甚至在不同物种之间都对野生水产动物的起源、亲缘关系、遗传多样性、遗传结构和动物进化程度起着重要的作用。在养殖群体中，D-loop区的分析正在渐渐起到重要的作用，若结合微卫星、RFLP等其他分子标记技术，将来对人工育种和对亲鱼、亲虾的选育工作有重大意义。

2细胞色素b序列（cytb）

线粒体DNA中编码蛋白质的基因有还原型辅酶I的亚基、ATP合成酶的亚基、细胞色素c氧化酶的3个亚基和细胞色素b[27]。Zardoya等[28]研究认为，cytb的进化速度适中，适合进行种内和种间的遗传分析。现今利用cytb序列多数用于种内和种间的遗传分化分析、遗传图谱建立和遗传多样性调查，并辅以其他标记技术进行组合分析。王晓梅等[29]获取中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)cytb序列的PCR产物后，利用DGGE技术分析了温州、仪征、江都、南京、盘锦和合浦地区的中华绒螯蟹的遗传多样性，并与合浦绒螯蟹(E.japonicahepuensis)对比，发现中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹遗传距离较大，在亲缘关系上具有显著的差异，但是仍有部分遗传标记相同，说明存在一定的基因交流。

黄小彧等[30]利用cytb序列检测了长江支流贵定与干流合江和宜都的中华倒刺鲃(Spinibarbussinensis)群体的遗传多样性，分析群体的遗传距离，结合地理因素分析了该物种的种质资源现状，发现合江的遗传多样性最好，而支流群体与干流群体的遗传分化较大，地理隔离使同一物种的基因交流程度降低。夏月恒等[31]利用cytb序列对中国近海3个地区的鮸鱼（Miichthysmiiuy）的遗传多样性进行分析，通过对地理环境和历史因素的解释，认为中国鮸鱼基因型的单倍型多样性高和核苷酸多样性低可能是因为种群在某个时期突然扩张，使单倍型突变大量产生，但这段时间对于提高核苷酸多样性时间不足，所以产生了如此差别；且Fst结果极低，说明该地区遗传分化程度很低，加上不同地理的单倍型网络图交错呈现，有可能是因为种群由于扩张之后还未达到平衡，需要对该地区进行保护。钟立强等[32]调查了长江中下游5个湖泊的黄颡鱼，利用cytb序列分析了不同地区遗传多样性和遗传分化的程度，60尾个体检测出37个单倍型，Fst分析显示这5个种群的变异大部分都来自群体内，说明各个种群间有一定的基因交流，系统树显示它们没有分化成谱系。司从利等[33]从长江贵定和乐山两个群体的泉水鱼cytb序列分析其遗传状况、结构和多样性程度，发现这两个群体由于三峡大坝的地理因素，已明显受到严重的影响，出现高度的遗传分化，建议对该物种进行分区保护，提高遗传多样性，丰富种质资源。

司从利等[34]在广东、广西等地基于cytb序列分析了华南居氏银鱼（Salanxcuvieri）的遗传现状，从邻接树上可发现有一定的分支，认为地理因素正在逐渐影响遗传结构，推测琼州海峡的地理位置可能影响广东、广西种群间的遗传交流；中性检测结果表明在更新世晚期发生扩增，地球当时的气候影响了该种群的遗传多样性；根据现状，建议分地区对该种群进行人为保护，避免出现种质退化。李伟文等[35]两年中在7个远洋捕捞点采集了黄鳍金枪鱼（Thunnusalbacares），扩增了cytb部分序列得到663bp，108尾个体仅有24个单倍型，且单倍型多样性和核苷酸多样性都处于较低水平，群体的遗传多样性较差；Fst分析得到变异大多发生在群体内部，表明其遗传分化程度较低，并且基因交流非常强烈，种质资源正在衰退，这与人类破坏环境和大面积捕杀有密切关系。谢楠等[36]利用cytb对鲂属（Megalobrama）4种鱼类及长春鳊（Parabramispekinensis）进行了系统分类。但在结果分析过程中仅靠cytb的信息难以准确将不同品种进行区分，仍需要配合其他标记进一步研究。

3其他标记与组合分析

16SrRNA序列、12SrRNA序列和COI序列在线粒体基因组中变异速度较慢，保守性较高，因此很难由其单独作为验证工具来进行遗传分析，往往需要结合其他的基因片段，才能同时作为鉴定种内亲缘关系和物种遗传多样性程度的工具。刘萍等[37]选取了山东青岛中华虎头蟹（Orithyiasinica）野生群体的16SrRNA和COI基因片段研究其遗传多样性，但是发现16SrRNA变异程度较小，效果不佳；在遗传距离和系统进化研究中，两种技术检测了不同蟹之间的亲缘关系以及它们的进化分化时间，利用NJ系统进化树发现中华虎头蟹与梭子蟹类的亲缘关系最近，并采用“分子钟”对4个蟹类的分化时间进行计算。吴玲等[38]对沿海6个群体的白氏文昌鱼（Branchiostomabelcheri）和日本文昌鱼（B.japonicum）分别进行COI和16SrRNA序列的研究，发现两种鱼种内遗传多样性较高，但还没有明显的遗传分化；其中茂名群体和威海群体具有最高的核苷酸多样性，很有可能为这两类鱼的祖先。

翁朝红等[39]对近江蛏（Sinonovacularivularis）、缢蛏（S.constricta）、小刀蛏（Cultellusattenuatus）、尖刀蛏（C.scalprum）和大竹蛏（Solengrandis）的COI和16SrRNA部分序列进行测序和分析，在进行遗传距离和系统演化分析后，结果表明近江蛏已进化至独立为一个种，并且通过聚类分析推断近江蛏应归属于竹蛏超科，解决了这几种蛏分类归属。郁建锋等[40]结合12SrRNA和16SrRNA的序列为太湖流域河川沙塘鳢的分类提供了重要的帮助，发现了大量的变异位点和简约位点，而且在两种标记的验证下，比较得出太湖流域河川沙塘鳢与福建流域河川沙塘鳢已经存在一定的遗传差异。同时，系统发育树分析表明，太湖流域河川沙塘鳢与其他鳢已存在遗传分化差异。王庆容等[41]对长江中上游舞阳河、乌江、雅砻江、岷江和金沙江5个野生鲇(Silurusasotus)群体的亲缘关系和遗传差异进行了分析，对比了核苷酸和单倍型多样性，发现舞阳群体与其他群体的亲缘关系较远。杨慧荣等[42]同时利用D-loop和cytb的序列对长江水系的赤眼鳟（Squoliobarbuscurriculus）进行了遗传多样性的分析，通过遗传变异率、单倍型多样性等指标发现长江赤眼鳟遗传多样性较高，种质状况较好；同时，根据Fst和分子变异等级差异分析发现，不同水系的群体存在明显的遗传分化；系统发育树证明了珠江水系赤眼鳟与长江水系赤眼鳟正在逐渐分化为两类群体，并提出cytb序列在变异显著的群体间更能发挥作用。

孙希福等[43]利用cytb序列和D-loop序列分析了江豚（Neophocaenaphocaenoides）在鼠豚类及一角鲸类的分类地位，系统发育树表明，江豚的遗传距离与一角鲸科较为接近，并确定棘鳍鼠海豚、太平洋鼠海豚及黑眶鼠海豚3种群有较近的亲缘关系，否定了之前仅凭借形态学的分类方式。毕潇潇等[44]在某一水产品公司采集了来自美国与荷兰的狭鳕（Theragrachalcogramma）、太平洋鳕（Gadusmacrocephalus）、蓝鳕（Micromesistiuspoutassou）和远东宽突鳕（Eleginusgracilis）4种不同属的鳕鱼，利用16SrRNA、cytb和COI序列比较了它们的序列结构，根据核苷酸分歧速率以及NJ系统发育树，将太平洋鳕、狭鳕和宽突鳕归为一支，也显示了它们较接近的遗传距离，给分类学提供了非常重要的理论基础。

4展望

线粒体分子标记技术主要用于物种的遗传多样性分析、亲缘、亲权分析和物种进化程度分析。该基因组功能重要且能稳定遗传，是物种个体基因组中变化速度较快且保留较好的部分。对D-loop区的序列进行测序、比对、计算和分析后能得到物种的种属分类、遗传结构、历史发育情况和遗传多样性状态。而且，D-loop区稳定的母系遗传，使得分析起源有较好可靠性，聚类分析结果准确。同时，细胞色素b和16SrRNA等序列虽然进化速度较慢，但其稳定性的特征可以得到较好保留，获得的插入、替换和缺失等突变可以持续遗传，以作为数据分析的可靠依据。在进行不同情况的分析时，可以结合一到两种分子标记技术，作为重要的辅助参考标记。

综上，在水产行业的遗传分析中，野生群体的遗传多样性是将来进行育种和引进的关键，通过线粒体分子标记技术对野生经济水产动物的遗传结构和遗传多样性分析是高效、准确和可靠的。其中单倍型多样性和核苷酸多样性表现了分子结构的变异程度，体现了野生群体种质资源的现状；遗传分化特征能表现群体的基因交流状况，表明了群体间自由交配的自由度；分子变异等级分析可以让我们了解不同地域群体突变的来源，表现了群体遗传结构的差异；中性检测等分析从分子层面揭示了鱼类的系统发育状况。

不同的分析方式阐述了水产动物的生长和生存状况。而养殖群体的种质资源是育种和繁殖的关键，通过线粒体标记技术的分析，可以更加准确地了解群体结构和亲缘关系，避免近亲杂交导致苗种退化，给养殖带来较大的便利。水产行业中，养殖群体规模较大，可以利用不同的分子标记技术的特点，结合地理分布、分化程度和表观特征，来帮助水产行业进行选育和养殖工作，获得对实际生产有最大利用价值的结果。

作者：杨子拓刘丽单位：华南农业大学动物科学学院