网箱养殖患病草鱼鉴别与感染

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草鱼Ctenopharyngodonidellus属鲤形目鲤科，是中国重要的淡水养殖鱼类，它与鲢、鳙和青鱼一起，构成了中国著名的“四大家鱼”．草鱼是草食性鱼类，已经有1700多年的养殖历史［1］．由于草鱼养殖具有周期短、肉味鲜美、经济效益高等特点，目前草鱼已经成为乌江网箱养殖量最大的鱼类品种．然而，随着乌江流域的工农业发展和人口增长，每年都有大量的工业和生活污水流入乌江，使乌江水质变差（尤其在枯水季节），鱼病发生频繁，给草鱼养殖造成了很大的经济损失．因此，其病害的防治显得十分迫切．目前，rRNA和rDNA作为分子指标广泛应用于细菌遗传特征和分子差异研究［2］．大量已知细菌的rRNA基因数据已被测定并输入了国际基因数据库，成为细菌鉴定和分类的参照系统［3］．本研究以患病草鱼为材料，对分离所得菌株采用16SrRNA基因序列测定，将测序结果输入国际基因数据库，通过同源性比对鉴定致病菌．然后用致病菌接种健康草鱼，进一步验证其致病性，从而为草鱼的病害防治提供病原依据．

1材料与方法

1．1试验材料患病草鱼标本（5尾）于2008年4月采自乌江上游主要支流中的偏岩河养殖场，采集时标本材料个体病征相似．其中2尾草鱼病症为烂鳃、烂尾、烂鳍，体表发红；3尾草鱼病症为烂鳃、烂鳍，体表、肠发红，肠道出血．

1．2细菌的分离用无菌棉签分别沾取患病草鱼体表患处、鳃部、肠内溶物、体内血液、肝脏表面和肝脏内部，并分别涂布于营养琼脂培养基平板上．将接种后的平板倒置于27℃恒温培养箱中培养12h．长出菌落后取出平板，将平板中不同的菌落分别转接到空白营养琼脂培养基平板中，转接后的平板倒置于27℃恒温箱中培养12h．重复此步骤几轮，直至一个平板中只长有一种菌落［4］．将纯化后的平板取出，对细菌的厚薄、大小、表面、边缘、隆起形状和颜色等进行观察记录．

1．3基因组DNA的提取和16SrRNA基因的扩增、测序及数据处理参见李顺等［4］的方法．

1．4细菌的回复感染

1．4．1细菌的培养将分离到的细菌接种于营养琼脂培养基平板上，置于27℃隔水式恒温箱中培养，直至长出菌落．

1．4．2细菌悬液的制备取已长出菌落的平板，在超净工作台上用灭菌生理盐水洗下菌苔于试剂瓶中制成细菌悬液，保存于冰箱中（4℃）．回复感染前，将细菌悬液用灭菌生理盐水分别以0，5，10，100和1000倍梯度稀释．

1．4．3细菌悬液体积分数测定用平板菌落计数法测定细菌悬浮液中活菌数目．各梯度菌液体积分数（细菌密度）约为1×1010，2×109，1×109，1×108，1×107个／mL．

1．4．4感染草鱼用于回复感染的健康草鱼取于乌江偏岩河养殖场网箱中，体长15～20cm，体质量80～150g，每组10尾．用不同体积分数的菌液以肌肉注射（1mL／尾）和浸泡两种方式感染试验鱼（两种方式都用以上几种梯度的菌液感染），对照组注射相同剂量的生理盐水．将以上试验鱼置于3m×3m的水泥鱼池中（水深70cm，连续充氧），连续观察15d．

2结果与分析

2．1菌落外部形态和革兰氏染色结果将纯化后的平板取出，对细菌菌落进行形态观察，再革兰氏染色［5］后观察．通过比较外部形态和革兰氏染色结果，从5尾患病草鱼中共得到7株不同菌株（表1）．

2．216SrRNA基因的扩增结果对分离到的7个菌株的16SrRNA基因进行PCR扩增，均扩增出一条约600bp的片段（图1）．

2．316SrRNA测序结果I菌株的测序结果（580bp，不包括引物序列）见表2（其余菌株的测序结果略）．

2．4菌株的鉴定对16SrRNA基因部分序列正、反方向测序的结果进行拼接，拼接后的测序结果输入到NCBI网站（）．利用BLAST工具，对序列进行同源性比对分析，所得结果见表3．

2．5回复感染将初步鉴定的以上细菌分别接种到健康草鱼，发现注射感染后致病体积分数在1×108～1×109个／mL之间．4．浸泡感染组和对照组在回复感染后的15d内均无明显症状．

3讨论

随着现代生物技术的飞速发展，16SrRNA基因序列分析技术在微生物分子检测及分类鉴定中得到了广泛的应用．以16SrRNA基因为目的基因的现代分子生物学技术能精确地揭示微生物种类及遗传的多样性，从而使16SrRNA基因序列分析成了微生物分类鉴定的主要依据，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及多样性的评估等领域，是一种客观和可信度较高的分类和鉴定方法［6］．本研究用微生物学常用的细菌分离纯化方法从患病草鱼中分离出7株菌株，分别扩增出了16SrRNA基因约600bp的片段．一般认为，16SrDNA序列同源性大于99％，可以认为属于同一种；同源性大于95％而小于98％，可以认为是同一个属的不同种；同源性在93％～95％之间，可以认为属于不同的属［7］．通过对16SrRNA基因序列进行同源性比对分析，初步鉴定Ⅰ为沙雷氏菌，II为腐生葡萄球菌，III为荧光假单孢菌，IV为产碱普罗威登斯菌，V为嗜水气单孢菌，VI为杀鲑气单孢菌，VII为不动菌属．将以上初步鉴定的不同细菌接种到健康草鱼，沙雷氏菌、腐生葡萄球菌、荧光假单孢菌、产碱普罗威登斯菌和嗜水气单孢菌在体积分数为1×108～1×109／mL时开始致病，对草鱼的危害较大，可以判断它们可能是网箱养殖草鱼发病的主要病原．杀鲑气单孢菌、不动菌属以及浸泡感染的症状不明显，加大体积分数是否致病有待进一步研究．在对细菌引起鱼类病害的研究中，对嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌可以引起鱼类及其他多种水生动物患病有大量报道［8－17］．

在本试验中，嗜水气单胞菌在接种后第3天开始死亡，试验期间死亡率为60％，主要症状为竖鳞、掉鳞和皮肤充血等，与其他学者的结果［10－11］相一致；杀鲑气单孢菌在本实验中的结果与其他学者的研究结果［18］不一致，我们将就此进一步研究以证实其是否致病．