电镜技术研究油菜油体形态大小论文

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编者按：本文主要从材料与方法；结果与分析；讨论三个方面进行论述。其中，主要包括：油体是植物种子的贮油细胞器、即使同一粒种子,不同组织中的油体大小也不相同、试验材料试验材料为甘蓝型油菜扬油6号、超薄切片与透射电镜观察将切过半薄切片的包埋块进一步修块、油体的分离油体的分离参考、油体观察油体的观察采用电镜负染色方法、油体大小的统计分析利用、胚子叶显微结构、胚子叶超微结构胚子叶超微结构、分离油体的形态观察分离的油体经负染色、油体大小的统计分析对分离的油体的大小进行统计分析、植物油体是植物贮油细胞器等，具体请详见。

摘要:研究油菜种子树脂半薄切片和超薄切片,发现胚子叶细胞被蛋白体和油体所充实,蛋白体为球状晶体蛋白体,油体大小差异较大,小油体呈球形,大油体呈椭球形。油体经分离和统计分析,表明小油体数量较多,平均直径为0.57μm;大油体数量较少,平均直径为2.39μm;不同大小油体的数量随着油体体积的增加而逐渐减少。

关键词:油菜;种子;油体

油体是植物种子的贮油细胞器,通常在子叶、胚乳或盾片中积累,为种子的萌发和植株的早期生长提供能量[1~3]。油体为直径0.5~2.5μm的球体,其大小因植物种类的不同而不同,且受营养和环境的影响。即使同一粒种子,不同组织中的油体大小也不相同[4]。Tzen和Huang提出的油体结构模型认为油体内部主要为三酰甘油酯(TAG)的液态基质,外部则为磷脂单分子层及嵌入其内的油体结合蛋白组成的半单位膜,这个半单位膜的基本单位是由13个磷脂分子和1个油体结合蛋白分子组成[5]。

油体结合蛋白占油体表面的20%,但仅占油体总成分的1%~4%,其中90%为油质蛋白(oleosin),少量其他蛋白,如钙结合油质蛋白(caleosin,Sop1)、固醇油质蛋白(steroleosin,Sop2)和Sop3等[5,6]。

研究表明,种子含油量与油体大小有一定关系,而油体大小受油质蛋白含量的调控[7~10]。无论在细胞中还是在离体状态下,油体均非常稳定,在干燥种子细胞内或在体外离心分离的悬浮液中,油体之间并不发生融合或聚合,甚至经过长时间的贮存也能保持稳定[11]。近年来对油体的研究已有许多报道,集中在油体的形态、油体的蛋白质成分、结构功能和分子水平,以及用油体构建的植物生物反应器生产外源蛋白等[12,13]。油菜是我国重要的油料作物,是研究油体的理想实验材料,但由于油菜的油体较小,目前缺乏快速便捷的用于油菜种子中油体观察的技术方法,限制了对油菜油体的研究。本文利用电镜技术,观察了油菜油体的形态和大小,为油菜油体的研究提供重要的参考。

1材料与方法

1.1试验材料试验材料为甘蓝型油菜扬油6号(Brassicana-pusL.cvYangyou6),种植于江苏里下河地区农业科学研究所试验基地。

1.2胚子叶样品包埋块制备将种子在ddH2O中于室温浸泡1d,去除种皮,将胚子叶切成约2mm×2mm大小的小块,于0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.2)配制的2.5%戊二醛固定液中,0~4℃冷室中固定2d,用相同的缓冲液洗涤3次,再以1%四氧化锇(缓冲液同前)在室温固定2.5h。四氧化锇固定后,用上述缓冲液洗涤3次,乙醇逐级脱水,Spurrs''''树脂渗透和包埋,60℃聚合2d,获得样品包埋块,干燥器中保存备用。

1.3半薄切片与光镜染色观察样品包埋块经修块后,在LeicaEMUC6超薄切片机上用玻璃刀切取1μm厚的半薄切片,然后转移到干净的载玻片上的一滴双蒸水上,70℃电热板上使切片伸展和干燥,60℃烘箱中烘48h以上备用。

半薄切片的光镜染色参考胡适宜和徐丽云的多重染色法[14],即切片经PAS(高碘酸-希夫试剂,period-icacid-Schiffs''''reagent)-苏丹黑B-考马斯亮蓝R依次连续染色后,置于Olympus光学显微镜下观察,用附带的成像系统拍照。

1.4超薄切片与透射电镜观察将切过半薄切片的包埋块进一步修块,用钻石刀在超薄切片机上切取厚度约70nm的超薄切片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后,在PhilipsTecnai12透射电子显微镜(荷兰)下观察,用附带的CCD成像系统拍照。

1.5油体的分离油体的分离参考Tzen等的方法[15],并作适当改动。

2g干种子在ddH2O中于室温浸泡过夜,去除种皮,研磨液(0.6mol/L蔗糖,10mmol/L磷酸钠缓冲液,pH7.5)清洗胚,然后在研体内,4℃下用10mL研磨液充分研磨。研磨液过三层纱布,收集滤液。将上述滤液加到50mL离心管中,小心在其上加10mL漂浮液I(0.4Mol/L蔗糖,10mmol/L磷酸钠缓冲液,pH7.5),10000g离心30min,然后收集上层油体,并用20mL去污清洗液(0.1%Tween-20,0.2mol/L蔗糖,5mmol/L磷酸钠缓冲液,pH7.5)悬浮油体。将油体悬浮液20mL加到50mL离心管中,小心在其上加20mL10mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5),10000g离心30min,然后收集上层油体,并用20mL离子洗脱液(2mol/L氯化钠,0.6moL蔗糖,10mmol/L磷酸钠缓冲液,pH7.5)悬浮油体。将油体悬浮液20mL加到50mL离心管中,小心在其上加20mL漂浮液II(2mol/L氯化钠,0.25moL蔗糖,10mmol/L磷酸钠缓冲液,pH7.5),1000离心30min,然后收集上层油体,并用少量研磨液悬浮油体,4℃保存备用。

1.6油体观察油体的观察采用电镜负染色方法。

将分离的油体用研磨液稀释合适浓度后,将带有Formvar支持膜的500目铜网在油体悬浮液滴上漂浮(有支持膜的一面向下)5min,用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体。然后再将铜网在磷钨酸负染色液的液滴上漂浮3min,用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体。铜网自然干燥后,在PhilipsTecnai12透射电子显微镜(荷兰)下观察,用附带的CCD成像系统拍照。

1.7油体大小的统计分析利用JD801形态分析软件测量油体的直径,从放大3000倍的油体电镜照片中,随机测量25个直径大于1.5mm的油体直径,测量10张照片,共2个油体;从放大10000倍的油体电镜照片中,随机测量50个直径小于1.5mm的油体的直径,测量张照片,共500个油体。利用EXCEL,分析计算数据平均值和标准差,并进行作图。

2结果与分析

2.1胚子叶显微结构胚子叶半薄切片经PAS-苏丹黑B-考马斯亮蓝R多重染色,细胞中的脂类被染成灰色,贮藏蛋白质被染成蓝色,细胞壁经PAS单染后呈红色,但在其后的苏丹黑B和考马斯亮蓝复染后,颜色变为深黑色(图1)。胚子叶细胞被贮藏的脂类和蛋白体

所充实,其中蛋白体分散在细胞中央,而脂类充满整个细胞(图1)。虽然脂类物质以油体的形式存在,但由于油体直径较小(0.57μm),半薄切片厚度较厚(1μm),因此光学显微镜下无法分辨出油体。

2.2胚子叶超微结构胚子叶超微结构表明,蛋白体多为近球形,体积较大,位于细胞中间,蛋白体内含有球状晶体,这些球状晶体在超薄切片时崩出,在蛋白体内留下电子透明的空洞,球状晶体颗粒在蛋白体内差异较大(图2)。细胞内油体大小差异较大,小油体多分布在蛋白体周围,呈球形;大油体多分布在细胞壁附近,呈椭球形(图2)。

2.3分离油体的形态观察分离的油体经负染色,利用透射电镜观察,表明油体明显分为大小两类,小油体数量较多而大油体数量较少(图3)。

2.4油体大小的统计分析对分离的油体的大小进行统计分析,发现油体的直径在0.1~6.0μm,其中在0.4~0.5μm之间的油体数量最多,直径大于0.5μm的油体,其数量随着油体直径的增加而减少(图4、5)。为了便于统计和分析,将直径小于1.5μm的油体定义为小油体,而直径大于1.5μm的油体定义为大油体。

从图4可以看出,小油体在直径小于0.5μm时,其数量随着油体的体积增加而增加,而在大于0.5μm时,其数量随着油体体积的增加而减少(图4)。图5显示的大油体的大小分布,表明大油体的数量随着油体体积的增加而逐渐减少(图5)。对大、小油体的直径进行统计分析,结果表明,大油体平均直径为2.39μm,小油体平均直径为0.57μm。

3讨论

植物油体是植物贮油细胞器,为直径0.5~2.5μm的小球体,其大小因植物种类的不同而不同,保持这种较小体积可以为脂酶提供最大的作用面积,同时也提高了TAG的流动性[4]。对植物种子中油体大小的研究一直受到人们的关注。Ting等研究发现,高油玉米品种具有较大的油体和较高的TAG/油质蛋白比[7]。Peng等对芝麻油体进行了人工合成,合成的油体大小与TAG/油体蛋白成正比[16]。

Siloto等通过在拟南芥中调控油质蛋白基因的表达水平,直接证明了油质蛋白的积累情况决定种子中油体的大小,而且油体大小的变化会影响种子内脂肪酸的累积[9]。油菜种子油体较小,对其形态和大小的研究较少。本文的超薄切片观察表明,油体大小差异较大,分布在蛋白体周围的油体较小,多呈球形,而其它部位的油体较大,形状多呈椭球。对分离的油体进行统计分析,表明油体以小油体数目居多,其平均直径大小为0.57μm,这与Tzen等[4]报道的0.65μm有差异,可能是由于实验方法不同造成的。

分离的油体和超薄切片都显示存在大油体,但数目较少,并且其数目随着体积的增加逐渐减少。

Heneen等观察燕麦胚乳发育,发现大油体是由小油体融合而形成,并且油体的大小与含油量有关[17]。

Hu等通过研究不同含油量油菜品种的油体大小发现在低含油量品种中具有较大的油体[18]。油菜大油体是如何产生的、油体的大小与含油量的关系等有待进一步研究。

参考文献:

[1]程红焱,宋松泉.种子的贮油细胞器:油体及其蛋白[J].植物学通报,2006,23:418-430.

[2]赵传志,卢金东,苏磊,等.以油体作为生物反应器的研究进展[J].生物技术通报,2008,(2):73-76.

[3]胡适宜,徐丽云.显示环氧树脂厚切片中多糖、蛋白质和脂类的细胞化学方法[J].植物学报,1990,32(11):841