预处理剂影响豌豆根尖细胞分裂论文

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【摘要】：本实验以豌豆为材料，用不同质量浓度的秋水仙素(0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0g/L)和8-羟基喹啉(0，0.002，0.004，0.006，0.008，0.010mol/L)作为预处理剂，设计处理时间为3.0h，分析了不同预处理剂对豌豆根尖细胞有丝分裂的影响。结果表明，(1)用1.0g/L的秋水仙素处理，(2)用0.004mol/L的8-羟基喹啉处理，处于有丝分裂中期的细胞数目百分率最高。

【关键词】：豌豆；预处理剂；8-羟基喹啉；秋水仙素

Abstract:Theeffectsofdifferentpretreatmentagentstomitosisofpease’sroottipcellswereanalyzedwithpeaseastherawmaterial,anddifferentcolchicinesdensities(0,0.1,0.5,1.0,1.5,2.0g/L)anddifferent8-HQdensities(0,0.002,0.004,0.006,0.008,0.010mol/L)aspretreatmentagentswithinthetreatmentperiodsof3.0h.Theresultsshowedthatthehighestpercentageofmetaphasemitoticisinthedensityof1.0g/Lcolchicinesandinthedensityof0.004mol/L8-HQ.

Keywords:pease;pretreatmentagent;8-HQ;colchicine

前言：

染色体是遗传物质最主要的载体，在有丝分裂过程中，染色体的形态和结构表现出一系列规律性的变化，尤其是分裂中期的染色体收缩程度良好，适于进行染色体形态的识别和研究。但是在整个细胞分裂周期中，中期细胞数较少，且染色体因纺锤丝的牵引而紧密排列在赤道板上，造成计数及识别染色体形态、结构的困难。为了获得较多的染色体分散好的中期细胞，常使用某些化学试剂，对材料进行预处理，使细胞同步分裂，提高细胞的分裂指数。

目前，国内已有不少用预处理剂处理各种材料的细胞分裂的报告，梁镇林等以大豆为材料，用0.002mol/L的8－羟基喹啉为预处理剂；张杏辉等以蚕豆为材料，用10.0g/L/的秋水仙素为预处理剂；秦素平等以大蒜为材料，用8-羟基喹啉和秋水仙素为预处理剂，都获得了同步化较好的分裂细胞。这些研究表明，要想得到较多、较好的有丝分裂细胞，选择合适浓度的预处理剂及处理时间是很关键的。但不同植物对不同的预处理剂的反应是不同的。

本实验以豌豆根尖为材料，用秋水仙素和8－羟基喹啉作为预处理剂，在不同浓度下处理豌豆根尖，目的在于寻找合适的秋水仙素浓度和8－羟基喹啉浓度。

1材料与方法

1.1材料与试剂

材料：豌豆：市售。

试剂：8－羟基喹啉，秋水仙素。

1.2方法

1.2.1根尖培养方法选择大小均匀无损伤的豌豆置于培养皿中,在室温条件下用蒸馏水培养。每天换水1次。待根尖长至1.5～2.0cm时于上午9:00～10:00取材。

1.2.2材料处理方法分别用质量浓度为0，0.1，0.5，1.0，1.5，2.0g/L的秋水仙素和0，0.002，0.004，0.006，0.008，0.010mol/L的8－羟基喹啉溶液处理豌豆根尖3.0/h，之后分别用卡诺氏固定液于4℃冰箱中固定10h，固定后的材料用1mol/LHCl在60℃恒温下酸解15min，用改良品红染色；采用常规压片法制片,选择有代表性的制片，每张制片统计4-5个视野，从中统计分裂细胞数及分裂中期细胞数。

有丝分裂指数=Σd/N×100

Σd：为各观察视野内分裂细胞数总和；

N：为各观察视野内细胞总数。

2.实验结果与分析

不同浓度的秋水仙素处理豌豆根尖细胞，具有一定的影响。结果表明，用1.0g/L的秋水仙素处理的豌豆，其分裂细胞处于分裂中期的数目最多。但是此后随着浓度的增加，处于分裂中期的细胞数目反而下降(表1)，这说明并不是浓度越高越好，只有适当的浓度才能达到使纺锤丝形成受阻率最高的目的。

不同浓度的8-羟基喹啉处理豌豆，其根尖细胞处于分裂中期的数目各不相同，结果表明，0.004mol/L8-羟基喹啉处理的豌豆中期细胞所占的比率最高，为58.97%。与其它处理浓度有比较明显的差异。8-羟基喹啉的作用机制是引起细胞质黏度的改变，结果导致纺锤丝的活动受阻。从表2可以看出，8-羟基喹啉对豌豆根尖有丝分裂有一定的影响，但当浓度超过0.004mol/L时处于细胞分裂中期的细胞百分率反而降低，因此只有适当的浓度才有利于抑制纺锤丝的形成，使分裂细胞更多地处于细胞分裂中期。

本次实验取材的方法会影响到实验结果，因为只有根尖才会有细胞处于分裂期，如果取材时切得稍微高一点，就会使得有丝分裂指数降低。数细胞时因为是取不同的视野进行数数，由于人为的原因会挑选一些比较理想化的视野，这也有可能导致了实验结果的不真实性，还有由于细胞数目太多，数数时也存在人为的误差。

表1.不同浓度的秋水仙素对豌豆根尖细胞有丝分裂的影响

处理剂浓度/（g/L）细胞总数分裂相中期细胞

数目指数%数目比率%

0546366.5938.30

0.1538417.62717.07

0.5567346.001235.29

1.0598437.192967.44

1.5572305.251136.67

2.0541397.21615.38

处理剂浓度/（mol/L）细胞总数分裂细胞数中期细胞

数目指数%数目百分率%

0528356.63514.29

0.002547315.671135.48

0.004589396.622358.97

0.006571366.311644.44

0.008562376.581232.43

0.010538295.39724.14

表2.不同浓度的8-羟基喹啉对豌豆根尖细胞有丝分裂的影响

3.讨论

一般来说，凡是进行分裂的分生组织、器官甚至单个细胞，都可用于染色体观察。但也不是随意取来上述材料都可以获得期望的结果。因此，适当取材是非常关键的。如果要研究染色体计数及核型分析，染色体最好应满足以下三个条件，(1)染色体所处的分裂时期应准确可辨；(2)染色体纵向浓缩均匀一致；(3)缢痕显示清晰。本研究就是以豌豆根尖为材料,经不同浓度的秋水仙素和8-羟基喹啉预处理,结果表明,经预处理的材料能较多地积累中期细胞,且染色体分散性好,易于进行更深入的分析研究。

另外,取材时间也是非常关键的。在一昼夜的时间里,以上午8:00～10:00时取材最好,此时豌豆根尖正处于分裂高峰期。

实际上,细胞分裂是不同步的。使用某些理化因素,对材料进行预处理可使细胞同步分裂,提高细胞分裂指数。良好的预处理方法能够积累较多的中期细胞,并能使中期染色体适当凝缩、分散。秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最初从百合科植物秋水仙（Colchicumautumnale）中提取出来，故名。分子式C22H25O6N。纯秋水仙素呈黄色针状结晶，熔点157℃。易溶于水、乙醇和氯仿。味苦，有剧毒。秋水仙素作为预处理剂,其主要作用有两方面,其一是抑制微管蛋白组装成纺锤丝,但并不抑制前期的细胞分裂,因此凡进入中期的染色体均被阻而不能进入分裂后期,这样便可以积累大量处于分裂中期的染色体。其二是它可以使染色体缩短变直,便于染色体分散和计数。8-羟基喹啉分子式C9H7NO，为白色或淡黄色结晶（或结晶粉末），几乎不溶于水和乙醚，而溶于乙醇或稀酸。所以配制8-羟基喹啉溶液时可以先将粉末溶于少量乙醇。8-羟基喹啉作为预处理剂的最大优点是显示缢痕清晰,染色体分散,适于染色体计数及核型分析或显带技术等。

4.参考文献

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