番茄病菌无毒基因研究论文

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论文关键词无毒基因；抗病基因；植物防御反应；过敏性坏死反应

论文摘要番茄细菌性斑点病是影响番茄产量和品质的重要病害，Pseudomonassyringaepv.tomato(Pst)为其病原菌，其与番茄的互作系统是研究植物抗感病机理的典型模式系统。Pst存在2种无毒基因：avrPto和avrPtoB，它们编码的蛋白质均能与番茄抗性基因P￡0编码的serThr蛋白激酶互作，符合Flor“基因对基因”学说。AvrPto和AvrPtoB在表达Pto的抗性植物中，与Pto互作，表现无毒功能，引发植物防御反应；而在缺失Pto的感病植物中，它们具有毒性，促进细菌的生长。本文综述了番茄细菌性斑点病菌无毒基因avrPto及avrPtoB的结构特点及其功能，这有助于了解病原物与植物的互作机制，对认识植物的感病性、抗病性以及植物防御反应都具有重要意义。

番茄是重要的经济作物，每年因病虫危害，造成其大量减产。番茄细菌性斑点病是危害番茄生产的重要病害之一，为一种世界性病害，主要危害番茄的叶、茎、花、叶柄和果实。自1933年首次报道以来，在全球26个国家均有发现，我国也于1998年发现。据报道，该病可造成5％～75％的产量损失。该病的病原菌是丁香假单胞番茄致病变种Pseudo—monassyringaepv.tomato(Pst)。

Pst与番茄的互作系统是研究病原物与植物互作的典型模式系统，该系统的无毒基因(avirulencegene，avr)和抗病基因(resistencegene，R)符合Flor“基因对基因”学说。当病原物中存在无毒基因avrPto或avrPtoB，寄主中存在并表达相应抗病基因Pto时，无毒蛋白就会与抗病蛋白相识别，激活植物防御反应系统，引起过敏性坏死反应(hypersensi—tivereaction，HR)，从而抑制细菌的生长。

本文综述了番茄细菌性斑点病无毒基因avrPto及avrPtoB的结构特点及其功能，从无毒基因的角度阐述病原物与植物的互作机制，这对认识植物的感病性、抗病性以及植物防御反应都具有重要意义。

1病原菌Pseudomonassyringaepv.tomato

Pseudomonassyringae是农业上重要的植物病原细菌，根据其宿主特异性，该菌可分为50多个致病变种Pst是其中的一个致病变种，该菌菌体短杆状，直或稍弯，单细胞，大小为(0.1～1)μm×(1.5～4)μm，革兰氏阴性，在含蔗糖的培养基上能产生绿色荧光，超过41℃不能生长。该菌株能够侵染番茄和拟南芥。

Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000是Pseudomonassyringaepv.tomato的模式种，2003年C.R.Buell等报道了它的全基因组序列，这是丁香假单胞菌属中第一个被完全测序的菌株，此工作的完成为研究Pst的致病机理奠定了基础。Pst存在2个小种：0号小种和1号小种，2个小种的区别在于它们对抗病番茄具有不同的毒力。在抗病番茄上接种Pst的0号小种，植物会产生HR反应；而在抗病番茄上接种1号小种，Pst大量增殖，引起感病反应。如果将O号小种或1号小种接种于不表达Pro的感病番茄植株上，它们都会引起番茄的感病反应。

2无毒基因简介

植物机体内存在防御机制，当植物受到病原菌侵袭时，能够检测到病原菌，从而延迟或抑制疾病的发生。植物的防御反应包括两种：一种是基础防御反应，包括细胞壁的加厚，防御相关蛋白的表达等；另一种是依赖于抗性蛋白的HR反应，是指在抗病植物中存在抗病基因(R)，其表达的抗病蛋白(R蛋白)能够识别病原菌Ⅲ型分泌系统(typeⅢse—cretionsystem，TTSS)的效应因子，与之互作，从而激活植物防御反应系统，引起过敏性坏死反应(HR)，过敏性坏死反应的主要表现就是引起侵染位点的局部快速的程序性坏死反应(programedcelldeath，PCD)，从而抑制侵染位点病原菌的生长和扩展。

病原菌必须克服植物防御反应，从中获得营养得以增殖，才能够使植物发病。很多革兰氏阴性菌侵袭植物都需要TTSS，病原菌通过TTSS将效应蛋白注入植物体内，这些蛋白进入寄主细胞后，可以通过修饰或改变寄主的关键蛋白来促使植物发病。目前已鉴定了50多种可以进入寄主细胞的病原菌效应蛋白，这些效应蛋白进入寄主细胞后，修饰或改变寄主的关键蛋白以改变植物的生理状态，抑制植物防御反应，从而提高病原菌的生存适合度，最终导致其大量增殖，致使植物发病。TTSS中编码Ⅲ型泌出通道的hrp(HRandpatho—genicity)和hrc(HRandconserved)基因、编码效应蛋白的avr(avirulence)和hop(Hrp—dependentoutprotein，依赖hrp的泌出蛋白)基因，均决定着植物病原细菌在寄主和非寄主植物上的反应。

无毒基因是病原菌的遗传因子，其编码产物能够激发病原物与寄主特异性互作。病原物无毒基因与植物抗病基因产物之间相互作用导致产生的基因对基因抗性是植物抗病性的重要形式。无毒基因(avr)被认为是一类两性效应因子(bifunc—tionaleffector)，在决定病原细菌的无毒性和致病性两方面均起作用：在含互补抗病基因植物中表现无毒效应，而在不含互补抗病基因植物中显示毒性效应。虽然大部分无毒蛋白的功能至今还不清楚，但已探清一些无毒蛋白的氨基酸序列和已知蛋白序列同源，如avrBs3、pthA以及avrb6都具有NLS(nuclearlocalizationsignal)序列，将含有放射性标记的基因嵌入到NLS区，能定位到细胞核中。这就表明，定位于细胞核对于发挥无毒基因功能是必要的。

Pst存在2种无毒基因：无毒基因avrPto和avrPtoB。这2种无毒基因均已克隆并获得全序列，1992年从Pst的O号小种中克隆到无毒基因avrP-to，2002年又克隆到了无毒基因avrPtoB。avrPto和avrPtoB序列一致性很低，分别编码具有18ku和59ku的蛋白质。关于它们的功能，2005年N.C.Lin等构建了DC3000△avrPto、△avrPtoB以及△avrPto△avrPtoB突变体，分别接种于感病番茄上，发现野生型DC3000引起的症状较单突变体的症状严重，单突变体的症状又较双突变体严重，而菌群数量没有差别。由此可见，avrPto和avrPtoB是Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000上仅有的无毒基因。

AvrPto—Pto和AvrPtoB—Pto符合Flor“基因对基因”学说。AvrPto和AvrPtoB通过TTSS进入到植物体中，在缺失Pto的感病番茄中，它们是毒性因子，能够促进细菌的生长；在表达Pto的抗病番茄中，它们作为无毒因子，能够引起宿主的HR反应。Pto存在于抗病番茄中，编码一个丝氨酸一苏氨酸(Ser-Thr)的蛋白激酶，它能特异性的识别avrPto或avrPtoB编码的无毒蛋白，激活植物防御反应系统，从而引发植物的抗病反应。

3无毒基因avrPto

3．1avrPto基因结构特点

无毒基因avrPto存在于PstO号小种中，于1992年首次分离。无毒基因avrPto编码一个由164个氨基酸组成的18ku亲水性蛋白质，其N末端具有十四烷基结构域和棕榈酸盐结构域，这两个结构域能将蛋白定位并稳定于植物细胞膜上。缺失．N末端十四烷基结构域的AvrPto突变体G2A，不能将AvrPto定位于植物细胞膜上，也不能与Pto互作，从而不能引起基于Pto介导的抗病反应。因此，推测无毒蛋白AvrPto在Pst的细胞质中合成，通过TTSS进入到植物细胞中，在植物细胞膜上与Pto识别、互作、引起植物的抗病反应。AvrP—to和其他无毒蛋白一样，在GenBank和EMBL中没有发现它的同源序列。

avrPto启动子上游具有hrp基因簇，该基因簇位于-42至-34区域，能够调节avrPto的表达，缺失突变-34区域能引起avrPtomRNA表达量急剧下降，因此该位点可能是转录因子的识别位点。-37至-31的核苷酸序列TGGAACC，除了存在于avrPto的上游以外，也存在于其他很多无毒基因的上游，例如，avrPph3、avrB、avrC、avrD、avrRpt2以及hrpAB、hrpF、hrpS。但是，还没有直接的试验结果证明该位点是转录因子的结合位点。

分析AvrPto—Pto互作的晶体结构，发现AvrPto—Pro的互作依赖于AvrPto的一端的螺旋束和GINP结构域(Gly-Ile-Asn-Pro)，它们分别能够与Pro蛋白激酶的P-1环和P+1环结合。

3．2avrPto的无毒功能

avrPto在表达Pto的抗病番茄上具有无毒功能，在缺失Pto的感病番茄上具有毒性功能。将Pst1号小种接种于表达Pto的抗病番茄中，引起寄主的HR反应；将avrPto采用农杆菌的方法转化到表达Pto的Nicotianatabacum和N.benthami—aria的叶片中，能够引起烟草的HR反应。说明AvrPto是一个能够单独起作用无毒因子，番茄Pto基因家族的成员能够直接或间接地识别它，引起抗病反应。

1996年Tang等通过酵母双杂交系统分析AvrP—to和Pto是否能直接互作，结果表明，AvrPto能与Pto发生高度特异性互作，而与Pto基因家族的其他成员不能互作。迄今为止，通过纯化的蛋白还不能证明AvrPto和Pto能否在体外互作，因此还不能证明是否有其他宿主蛋白参与互作。后续的研究发现要激活植物抗性，除了需要AvrPto和Pto外，还需要富含亮氨酸重复(leucine-richrepeat，LRR)的Prf蛋白、F—box蛋白SGTl以及HSP90。

为了研究AvrPto—Pto互作机制，Shan等构建了AvrPto的多个突变体，发现AvrPto的164个氨基酸并不都是与Pto互作所必需的。Lin等构建重组AvrPto蛋白，即第1～9个氨基酸包含十四烷基化结构域和十六酰基化结构域和部分AvrPto蛋白(29～133)组成融合蛋白，通过农杆菌方法转化到表达Pro基因的抗性番茄中，发现仍然能够引起HR反应；去掉N末端的30个氨基酸以及C末端的40个氨基酸也不影响AvrPto与Pto在酵母双杂交系统中的互作，说明AvrPto的N末端和C末端并不是AvrPto—Pto互作所必需的；点突变AvrPto蛋白164个氨基酸中的60个不影响其与Pto的互作。

一直以来，人们认为AvrPto与Pro互作激活了Pto的激酶活性，然而，最近研究AvrPto—Pto复合体的晶体结构发现，AvrPto—Pto互作并没有改变Pto激酶活性，而是激活了Prf的活性。在缺失AvrPto时，Pto激酶上的β-1与P+1环能够抑制Prf活性，从而抑制其介导的抗性反应；一旦AvrPto与Pto互作，Pro激酶上的β－1和P+1就会和AvrPto上的螺旋束以及GINP结构域(Gly-Ile—Asn-Pro)互作，从而改变了Pto与Prf原有的互作方式，激活Prf，引起Prf介导的抗病反应。

研究还发现AvrPto有2个显著的结构域，其中由S94、I96和G99所编码AvrPto的结构域对于识别Pto蛋白中N145、P146、S147和S153编码的结构域很重要，它们可能参与AvrPto—Pto互作。

3．3avrPto的其他功能

AvrPto除了能够和Pto互作，引发Pto介导的抗病反应之外，还能够抑制番茄上非寄主病原菌引起的HR反应。Pseudomonassyringaepv.tomatoTl是N.benthamiana的非寄主病原菌，它能够在N．bentharniana上引起HR反应。然而在此植株上如果同时接种Pseudomonassyringaepv.tomatoT1和P.s.pv.tomatoDC3000时，这种坏死反应就会被延迟；对AvrPto的突变体研究发现，AvrPto的某些结构域对于抑制PCD是必须的，如G2A，P146L以及N末端的12个氨基酸。因此，抑制宿主PCD反应是成功侵染宿主植物的策略之一。

4无毒基因avrPtoB

avrPtoB广泛存在于植物病原细菌各菌属中，包括假单胞菌属(Pseudornonas)、黄单胞菌属(Xan—thornonas)、雷尔氏菌属(Ralstonia)和欧文氏菌属(Erwinia)。无毒蛋白AvrPtoB一方面在感病植株中能够增加细菌的毒性，抑制番茄免疫反应及PCD，促进细菌的生长；另一方面在抗病植物中，AvrPtoB通过Ⅲ型分泌系统进入植物细胞，与抗性蛋白Pto互作，引发HR反应。

4．1avrPtoB的发现

avrPtoB是偶然发现的，在研究avrPto时，将avrPto的缺失突变菌株接种于表达Pto的抗病番茄中，结果发现仍然存在HR反应。这就表明在丁香假单胞菌中可能存在第2个无毒基因，它和avrPto一样，能够与Pto互作，引起抗性反应。为了分离出该基因，Kim等利用酵母双杂交系统，以Pto蛋白为诱饵，在P.s.pv.tomatoDC3000的文库中筛选和Pto互作的基因，进而找到了avrPtoB。进一步研究证明AvrPto和AvrPtoB都是引起Pto介导的植物抗病的效应因子。

4．2avrPtoB的结构特点

avrPtoB编码一个59ku的蛋白质，该蛋白是一个组成性的蛋白质，可以分为N末端和C末端两部分，Abranmovitch等构建了仅包括N端1～308个氨基酸序列的AvrPtoBC末端缺失突变体，发现该突变体能够在酵母双杂交系统中与Pto互作，并能引起N.bentharniana的HR反应。由此可见，AvrPtoB的N端是其与Pto互作所必需的。AvrPtoB的C端(308～533)具有CDS(celldeathsuppressor)的活性，能够抑制寄主植物的PCD反应。同时其还具有的GINP结构域，虽然对于AvrPtoB—Pto的互作没有影响，但会影响Pto引起的HR反应。Kim等构建GINP位点突变体发现，AvrPtoBC末端的44个氨基酸对于抑制细胞程序性坏死反应是必须的，当突变该44个氨基酸，AvrPtoB突变体就会引起，N.bentharniana上的程序性坏死反应，这种PCD反应的获得表明AvrPtoB的CDS活性能够抑制Pto引起的PCD反应。

4．3avrPtoB的分类地位

avrPtoB与virPphA是同源基因，它们同属于HopAB基因家族的不同亚族群，其核酸有70％的序列一致性，氨基酸有52％的一致性。HopAB基因家族包括3个亚组群HopABl、HopAB2和HopAB3，分别代表基因virPphA、avrPtoB和hop-PrnaL。其中，virPphA是P.syringaepv.phaseolicola(Pph)的毒性基因。

4．4avrPtoB的功能

在抗病番茄中，AvrPtoB像AvrPto一样，在Prf存在的情况下，能够和抗病蛋白Pto互作，引起HR反应。

在感病番茄中，AvrPtoB是PCD的抑制因子，能够抑制PCD反应，促进细菌的生长。研究发现，转化AvrPto和Pto到N.benthamiana中，能够引起HR反应；因此，人们推测当AvrPtoB和Pto在N.benthamiana中共表达的时候，也应该能够看到HR反应，然而结果却发现，AvrPtoB和Pto共表达时没有发现基于HR的PCD反应，而是引起感病反应。前人研究发现avrPtoB的同源基因vir—PphA能够抑制基于HR的PCD反应。因此推测avrPtoB也具有此功能，即Pto识别AvrPtoB，而AvrPtoB抑制PCD反应。进一步研究发现，AvrPtoB不仅抑制Pto介导的PCD，还抑制抗病蛋白Cf9和小鼠蛋白Bax介导的PCD以及酵母的PCD。由此可见，AvrPtoB可能作用于真核生物PCD的一个保守因子，从而抑制PCD反应。

AvrPtoBN端的307个氨基酸具有识别Pto和介导Pto抗病的功能，C末端具有CDS活性，该CDS活性与病原菌致病性有关。RG-ptoll是Pto基因突变的番茄品种，当接种野生型DC3000至RG-ptoll，能够引起番茄细菌性斑点病。DC3000：rout5是C末端缺失的avrPtoB突变体，接种其到RG-ptoll的植株上，却引起HR反应。当转入含有完整avrPtoB的质粒到该突变体中，就会恢复DC3000：mut5对RG-ptoll的致病性。由此可见，AvrPtoB的CDS活性的丧失会令宿主获得对PstDC3000的免疫性，而重新获得CDS活性又会使宿主感病。因此，CDS的活性与病原菌的致病性有关，AvrPtoB的C末端能够抑制基于HR的PCD反应。

基于以上实验现象，推测AvrPtoB的CDS区可能和另一个隐性抗病基因Rsb(resisteneesup—pressedbytheAvrPtoBC-terminus)互作，Rsb基因还可能是Pto基因家族成员之一。因此，avrP—toB能够识别2个抗病基因：Pto和Rsb。在表达Pto和Rsb的番茄中，还可能存在一个T因子，该因子能够增强AvrPtoB—Pto或AvrPtoB—Rsb引起的免疫反应，抑制CDS活性。所推测的作用机制如下：a.存在T因子的情况下，R蛋白虽然识别AvrP—toB的CDS区，但是T因子和R蛋白能够联合抑制AvrPtoB的CDS活性，从而引起HR反应。如：在存在T因子、表达Pto和Rsb的抗病番茄中，T因子和Pto能够抑制AvrPtoB的CDS活性，从而引起基于HR的PCD反应．b.缺失T因子的情况下，R蛋白能够识别CDS区，同时CDS抑制了R蛋白介导的PCD反应。如：N.benthamiana表达Pto和Rsb却缺失T因子，不能抑制CDS活性，因而AvrPtoB抑制Pto和Rsb介导的基于HR的PCD反应，使烟草感病；c.存在T因子却缺失R蛋白的情况下，T因子不能和R蛋白一起抑制CDS因子的CDS活性，因而CDS因子抑制其他因子引起的HR反应。如：RG-ptoll不能正确表达Pto，而抑制AvrPtoB的CDS活性需要T因子和Pto的共同作用，因而AvrPtoB的CDS活性能够抑制Rsb介导的PCD反应，使植物感病。

5无毒基因avrPto和avrPtoB区别

虽然avrPto和avrPtoB都是Pst的无毒基因，但是无论从核苷酸水平还是氨基酸水平它们都具有很大差异。avrPto仅在假单胞属中发现，而avrP—toB广泛存在于4个属中；avrPto编码18ku蛋白质，而avrPtoB编码59ku的蛋白质；它们虽然在蛋白质的N末端和C末端序列具有相似性，但是AvrPtoB的N端缺乏十四烷基结构域。

AvrPto和AvrPtoB在感病植物上引起的症状不尽相同，AvrPtoB在感病番茄或者是烟草上，不能够引起严重的泛黄和坏死，而AvrPto可以。因此，AvrPto和AvrPtoB虽然都作为毒性因子，它们的靶标却可能不同。可以看出，AvrPto和AvrPtoB都能够与Pto互作，但是它们可能还需要其他一些不同的宿主蛋白参与下游细胞信号转导。

AvrPto—Pto互作方式和AvrPtoB—Pto互作方式相似，但是也存在不同之处，研究发现构建的2个Pro突变体能够破坏AvrPtoB—Pto的互作，但是却不能破坏AvrPto—Pto的互作，这就表明2个无毒蛋白与Pto的结合位点不同。

AvrPto和AvrPtoB都存在GINP的保守结构域，但是功能可能不同。AvrPto蛋白的GINP结构域位于亲水性的Ω环上，可能参与AvrPto—Pto互作，突变AvrPto的GINP结构域，就会破坏其与Pto的互作。然而，AvrPtoB的GINP结构域不参与AvrPtoB—Pto互作，却可能参与Pto介导的HR反应，AvrPtoB的GINP突变体使AvrPtoB—Pto互作能力减弱，但不会完全破坏其互作。

6结束语

AvrPto和AvrPtoB都能够在Pto表达的抗病番茄中引起HR反应，AvrPto能够抑制非宿主病原菌引起的HR反应，AvrPtoB在Pto缺失的番茄中，能够抑制PCD反应。可见，它们同时具有无毒功能和毒性功能，在表达Pto的植物中，表现无毒功能，与Pto互作，引发植物防御反应；而在缺失Pto的植物中，具有毒性功能，促进细菌的生长。

对无毒基因的研究不仅可以了解抗病基因作用过程中信号识别与传导，了解病原物与植物的互作机制，同时还对认识植物的感病性，抗病性以及植物防御反应都具有重要意义。