自生固氮菌的隔离鉴别

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摘要：从非豆科作物根际土壤中分离筛选得到213个在无氮培养基上能良好生长的菌株，通过酶活测定，从中筛选得到18株固氮能力较强的菌株，并对其中酶活最高的4株菌株进行了鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。利用它们可望制成适合于不同农作物生长的生物复合肥。

关键词：自生固氮菌；固氮酶；微生物肥料

0引言

微生物肥料的一些作用和生态效益是化学肥料所不具备的[1]，施用微生物肥料，能提高土壤肥力，刺激作物生长和抑制有害微生物的活动，从而达到增产的目的[2]。此外，生产微生物肥料投资少，可利用农副产品就地取材。因而，微生物肥料的生产吸引了许多研究者的兴趣。本文报道从水稻、小麦、玉米和蔬菜等非豆科作物根际土壤中分离得到18株固氮能力较高的自生固氮菌，并对其中am65、bn72、cx58t、dy82四株固氮能力最高的菌株进行了分类鉴定，结果表明它们属于固氮菌科的不同属。

1材料和方法

1.1菌种

采集水稻、小麦、玉米和蔬菜等农作物的根际土壤土样56个，从中分离获得213株在无氮培养基上能良好生长的菌株。

1.2分离培养基及分离方法

1.2.1富集培养基

蔗糖15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙1g，质量分数为10%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁(现配)水溶液各1mL，水1000mL，pH为6.5～7.0，在250mL三角瓶中，每瓶分装30mL，灭菌备用。

1.2.2富集培养方法

取3～5g土样用50mL水制成混浊液，吸取5mL悬浮液装入盛有30mL富集培养液的250mL三角瓶中，100rpm，28℃，培养3～5天后，换新鲜培养基继续培养，重复4～5次后，稀释分离。

1.2.3平板分离培养基

在富集培养基中加入2%琼脂制成平板分离培养基，灭菌后，倒入无菌培养皿中备用。

1.2.4分离方法

取富集培养后的培养液，稀释涂布平板分离培养基。28℃培养2天后，将在稀释度较大的平板上，生长较大的菌落移入斜面。培养后，保藏备用。

1.3固氮酶活性测定

1.3.1气相色谱法

参考文献[3]的方法，略加改变，将2mL乙炔气体冲入试管斜面内，塞上无菌橡皮塞，28℃，培养24h后，用气相色谱仪测量固氮酶的活性，每种取4～5个重复，进样量100μL，按以下公式进行计算酶活。

EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

(μmol/h(斜面))

Se：乙烯峰面积;T：开氏绝对温度(T=273.13K)

Pe：实验条件下的大气压强(Pa);

Sb：乙炔峰面积;Te：实验条件下的温度(K);

P：绝对大气压强(P=101324.72Pa);

t=培养时间(t=24h)

1.3.2微量凯氏定氮法[4]用以下公式计算含氮量：

EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)

V1：样品滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;

V2：空白滴定时用去的0.01N标准硫酸溶液毫升数;

14：是1个毫克当量氮的毫克数;

V：发酵液样品毫升数。

2结果和讨论

2.1分离结果

从非豆科作物根际土壤中分离得到213个菌株，用气相色谱法和微量凯氏定氮法测定它们的固氮酶活性。结果发现，34株没有固氮能力(含氮量<1mg/L)，161株有固氮能力(含氮量1～10mg/mL)，18株固氮能力较强(含氮量>10mg/mL)，其中am65、bn72、cx58和dy82四株菌产酶能力最高。表1对固氮能力较强的18株菌株的酶活测定结果进行了统计。

表1：固氮酶活力测定结果(18株菌株)

表1中，EA1(μmol/h斜面)是用气相色谱法测定各菌株的试管斜面的固氮酶活性值。按以下公式计算：EA1=(58.0×Se×T×Pe)/(Sb×Te×P×t)

虽然理论上，在固定条件下，乙炔还原活性与固氮酶对氮气的固定活性呈正相关，但在实际实验过程中，会由于斜面的新鲜程度，斜面培养基中的某些组成等原因，而影响实验结果的准确性，所以，每种菌都取5支对数生长期的斜面做重复试验，以尽量减少误差。EA2(mg/L)是将菌株接种到无氮培养液中，28℃，100rpm培养7天后，用微量凯氏定氮法测定最终发酵液的含氮量。按以下公式计算：EA2=((V1-V2)×14×1000)/V(mg/L)经回归分析[6]，EA1与EA2呈强正直线相关(相关系数r=0.9527)，回归方程为EA2=7.9560+0.5016×EA1，其结果与文献[3]的有关报道相似。

2.2鉴定结果

2.2.1形态特征见表2所示。

表2形态特征

2.2.2生理生化特征见表3所示。

表3生理生化特征

表4褐球固氮菌、拜氏固氮菌和敏捷单孢菌模式种的特征[5]

2.2.3命名

根据以上形态和生理生化特征，参照[伯杰细菌鉴定手册](表4、表5列出了其中有关模式种的鉴别特征)，将以上四株菌命名如下：

am65：与固氮菌科，氮单胞菌属的敏捷单胞菌相近，但甘露醇发酵及淀粉分解试验与模式种不同，暂定名为氮单胞菌am65(Azomonassp.am65)。

bn72：与固氮菌科，固氮菌属的褐球固氮菌相同，定名为褐球固氮菌bn72(Azotobacterchroococ-cumbn72)。

cx58：为固氮菌科，拜叶林氏菌属。兼有弗来明拜叶林氏菌和运动拜叶林氏菌的部分特征，其种的特征还有待于进一步鉴定，暂定名为拜叶林氏菌cx58(Beijerinckiasp.cx58)。

dy82：与固氮菌科，固氮菌属，拜氏固氮菌相同，定名为拜氏固氮菌dy82(Azotobacterbeijerinckiidy82)。

表5拜叶林氏菌属内运动拜叶林氏菌和弗来明拜叶林氏菌的特征[5]

注：+：少数细胞，绝大多数在幼龄时期;*：数字是代表在培养基上生长的菌株的百分数;

+(-)：大约所测定菌株的40%～50%为阳性;++：生长好;-/W：反应阴性或弱。

参考文献：

[1]陈廷伟,葛诚.我国微生物肥料发展趋向[J].土壤肥料,1995,(6):16～20.

[2]李元芳.有效活菌数的测定方法允许差与判定[J].土壤肥料,1997,(4):43～44.

[3]程萍.固氮菌肥料生产菌株的酶活性测定[J].土壤肥料,1995,(1):44～46.

[4]无锡轻工业学院等合编.食品分析[M].北京:轻工业出版社,1991.216～219.

[5]布坎南RE,吉本斯NE等.伯杰细菌鉴定手册[M].第八版.北京:科学出版社,1984.12.

[6]潘维栋.数据统计方法[M].上海:教育出版社,1984.8.