IVM对鲫鱼影响研究

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本文作者：彭章晓1,2江敏1吴昊1何琳1杨李1作者单位：1.上海海洋大学水产与生命学院2.上海交通大学药学院

伊维菌素(Ivermectin，ivm)为阿维菌素的衍生物，是由链霉菌产生的一种大环内酯类物质，具有用量小、效果好、安全性高等特点，在农牧业中常作为抗寄生虫剂和杀蜻剂使用。随着水产养殖规模和密度的不断扩大，一些寄生虫病如鲺病、车轮虫病、指环虫病和异尖线虫病等给水产养殖业造成的损失与日剧增，甚至可能危害人类健康［1］。作为一种新型、高效的鱼类抗寄生虫药剂伊维菌素在国外水产养殖中已有一定范围的使用。欧洲许多国家如苏格兰、爱尔兰等将其添加到饲料中，用于鲑鱼和海鲷养殖中的海虱防治［2－3］。我国主要将其应用于淡水鱼养殖中的斜管虫、车轮虫病防治［4－5］。目前，有几篇文献报道了IVM对哺乳动物的毒性作用，如Lankas等［6］实验表明IVM不具遗传毒性和潜在致癌性;Abeer等［7］实验结果显示，当与P－糖蛋白抑制剂联合使用时，IVM会影响雄鼠的生殖系统;Muhamad等［8］研究发现，IVM还会一定程度上影响动物的免疫力。IVM现在作为渔药使用范围越来越广泛，因此除了要关注它的环境毒性外，研究它对养殖鱼自身的毒性作用也是很有必要的，硬骨鱼类的血脑屏障发育不完善，因此IVM较易到达鱼的头部，但目前关于IVM在鱼体内的毒理学方面研究甚少。鱼类的血液指标与许多因素有关，如机体的年龄、营养代谢状况、健康状况等。当鱼体受到外界因子的影响而发生生理或病理变化时，必定会在血液指标中反映出来，因此血液指标常被用来评价鱼类的营养、健康状况及对环境的适应性，是重要的生理、病理和毒理学指标［9］。本实验以不同给药剂量研究了IVM对鲫(Carassiusauratus)血液成分的影响，以期评价IVM对鲫的毒性效应，为IVM的科学使用和管理提供一定的依据。

1材料与方法

1.1实验动物

鲫购自上海果园集贸市场，健康无伤病，平均体重(250±20)g。实验前在循环水养殖箱(250cm×150cm×70cm)中暂养30d，水温控制在(25±1)℃，增氧机充氧，投喂全价鱼饲料(浙江恒兴饲料有限公司)，暂养期间死亡率低于5%。

1.2仪器与试剂

实验所用仪器:纯水机(Milli－Q)、电子天平(FA2004)、超低温冰箱(ThermoForma－700)、全血分析仪(BC－2800Vet)和生化分析仪(BS－200)等。所用药品:IVM标准品(Sigma公司)、无水乙醇和肝素钠均为分析纯(国药公司)、Milli－Q超纯水、总蛋白(TP)测定试剂盒(双缩脲法)、白蛋白(ALB)测定试剂盒(溴甲酚绿法)、总胆红素(Tbil)测定试剂盒(Tb－D:重氮法)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(紫外－乳酸脱氢酶法)、碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(AMP缓冲液法)和钙测定试剂盒(Ca－O邻甲酚酞络合酮终点法)，上述试剂盒均购自迈瑞生物医疗电子股份有限公司。

1.3给药与采样

将实验用鲫随机分成A、B、C、D、E五组，每组27尾。A、B、C三组口灌给药，给药剂量分别为3.0、1.0、0.4mg/kg，以无水乙醇为溶剂;D组口灌与前三组等体积的无水乙醇作对照，每条鲫鱼灌入的无水乙醇的量小于0.3mL;E组不做任何处理。给药前6h禁食，给药后6h投饵。分别在给药后1、2、4、8、16、24、48、96、192h取样，每个时间点每组均取3尾鱼，抽取鲫血液后分成两份，置于含少量1%肝素钠(已风干)离心管中。一份立即进行全血分析，另一份经离心5min后分离血浆(离心力2000g)，于－80℃保存用于血液的生化分析。

1.4血样分析

鲫经静脉采血后立即进全血分析仪进行分析。用于生化组分分析的血浆从－80℃冰箱中取出后，在0℃的条件下解冻，将解冻后的血浆摇匀后进生化分析仪分析。

2结果

2.1IVM对鲫血细胞的影响

口灌IVM对鲫血液中红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血小板(PLT)、红细胞压积(HCT)、血红蛋白(HGB)等指标的影响结果见表1。组间单因素方差分析可知，实验组鲫RBC、WBC、HGB、HCT与对照组间均无显著性差异，而PLT则与对照组存在组间显著性差异(P=0.043＜0.05)。双样本等方差t－检验显示:D组和E组间无显著性差异，D组和A、B、C组间均存在显著性差异(P值分别为0.02、0.016和0.007，均小于0.05)，表明口灌IVM对鲫PLT数量有显著影响。图1显示，不同采样时间，给药组鲫的PLT数量波动较大:给药后8～16hPLT数量快速增加，16～24h数量相对稳定，24h后PLT的数量开始下降，至192hPLT值逐渐恢复到对照组水平。A(3mg/kg)组给药16h后开始出现死鱼，解剖后可见肾脏有出血迹象，这与Mladineo等［10］观察到的IVM使海鲷肾脏点状出血现象一致。本实验还发现A(3mg/kg)、B(1mg/kg)组鲫食欲明显减退，而且体色明显深于其它组鲫。

2.2IVM对鲫血浆生化成分的影响

表2为口灌IVM后鲫血浆中钙离子(Ca2+)、总胆红素(Tbil)、总蛋白(TP)、碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和白蛋白(ALB)6种生化成分的变化。单因素方差分析显示，Tbil、Ca2+、ALP、ALT和ALB5个指标无组间显著性差异，而TP指标则存在组间显著性差异(P＜0.05)。A组鲫TP浓度显著低于对照组D和空白组E;B组鲫TP与D、E组相比虽有所下降，但并不显著;而C组鲫的TP浓度为41.8mg/kg，与D、E组接近。表明高剂量IVM会降低鲫鱼血浆TP浓度，浓度越高，这种作用越明显;而低剂量组(0.4mg/kg)的IVM不会影响血浆TP浓度。各组鲫血浆TP含量在不同取样时间点间则无明显变化。

3讨论

鱼类血液与机体的营养、代谢及疾病有着十分密切的关系，血液指标能直接反映出鱼体的生理或病理变化，因此血液指标常被用来评价鱼类的健康、营养状况及环境适应性，是非常重要的生理、病理和毒理学指标［11］。HCT、HGB和RBC是与红细胞相关的重要参数，本试验结果显示IVM对鲫血液中这3项指标均无明显影响。Katharios等［12］以0.8mg/kg的剂量，给海鲷单次腹腔注射给药后发现:IVM会使海鲷HCT下降，对HGB和RBC无明显影响，他们认为给药后海鲷HCT的下降可能与溶血有关。本实验A、B、C、D、E5组的HCT随取样时间都有波动，但这种波动并未呈现明显的规律性，而且给药组A、B、C和溶剂对照组D、空白对照组E之间的HCT也没有显著差异。鱼血液中RBC和HGB含量与肌细胞供氧有一定关系，若血液中RBC和HGB含量下降，可能会影响肌细胞氧气的供应，从而影响鱼的运动能力。实验组A和B中的鲫游动缓慢，身体失衡，但检测并未发现这两组鲫RBC和HGB含量有明显变化。有文献表明，IVM具有神经毒性，可引起运动失调［13］。因此我们推测高剂量组鲫游动失常很可能是由于IVM的神经毒性引起的。

PLT是血液中一种与凝血有关的有形成分，鲫血液中PLT值的正常范围尚没有统一标准，给药后鲫PLT数量出现了较大波动，这一波动是否在正常范围内目前还不清楚。但本实验中高浓度组(3mg/kg)出现了死鱼，且有肾脏出血迹象，这与PLT数量的波动之间是否存有直接关系有待深究。白细胞(WBC)的主要生理功能是参与免疫应答，在鱼类疾病防治过程中发挥着重要作用。Katharios等［12］研究发现IVM能使海鲷的淋巴细胞和单核细胞数量上升，他们认为这是海鲷对IVM的一种免疫应激反应。但本实验条件下未发现IVM对鲫总白细胞数有明显影响。

Tbil、ALB、ALP和ALT主要是反映机体肝胰脏功能的血清指标。研究表明，本实验条件下给药组的Tbil、ALB、ALP和ALT浓度和对照组并无显著差异，说明这种药物对鲫肝胰脏并未产生明显的生理毒性。血浆中总蛋白(TP)浓度反应了机体的营养健康状况，鱼体生病、受伤和饥饿都会导致TP浓度下降，章龙珍等［14］研究发现，全光照和全避光条件下中华鲟幼鱼血浆TP含量均显著低于自然光照组。血浆TP浓度的下降可能是TP合成减少或消耗增加。肝胰脏是血浆蛋白质合成的主要场所，肝胰脏损伤或营养不良都会导致蛋白质合成受阻，但从ALB、ALT、ALP、Tbil指标来看，IVM对鲫肝胰脏并无明显损伤。实验中发现A、B组鲫会出现食欲不振、身体失衡、游动缓慢等现象。食欲不振会导致鲫营养不良，同时病理状态下鲫鱼蛋白质消耗会增加，因此鲫血浆中TP浓度的下降可能是由这两方面因素共同作用的结果。

因此，建议在实际养殖生产中，IVM施药剂量尽量小于0.4mg/kg，尽管此剂量仍在一定时间段内影响鲫血液中血小板的数量，但4d后可恢复至正常水平，且对鲫其他血液指标并无明显影响，相对安全。