君白菊组织培养研讨

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君白菊具有疏散风热、平肝明目、清咽润喉、护肝正气等药用价值，还是唯一不需使用任何农药的高品质饮用菊花茶，含有人体保健最需要的17种氨基酸和8种矿物质，无论在营养、口感还是在保健方面都超过了传统茶菊，它的胎菊中维生素E含量高出一普通饮用菊花数倍，拥有很好的抗衰老功效。君白菊也是重要的林下经济栽植品种君白菊在种植上具有抗寒、抗旱、抗病虫害等特点，对环境条件要求不高，可以充分利用林下空地进行合理栽植，既构建形成了稳定的生态系统、增加了生物多样性，又为农民创造了客观的经济收人，实现了资源共享、经济共赢的复合经营模式。笔者首次对君白菊微体繁殖和叶片不定芽再生体系进行了研究，建立了以此为基础的两个扩繁体系，为君白菊在经济、生态等方面的综合价值开发和利用奠定了快速繁育的技术基础。

1材料与方法

1.1实验材料

供试材料为盆栽君自菊植株，每月用2%。的NaclO消毒液对其进行l次消毒。实验于2009年12月至2010年3月进行取材，选取健壮无病虫害的茎，剪取顶端以下3一4个幼嫩的带腋芽的茎段作为实验材料。

1.2微体快繁体系的建立

1.2.1最佳消毒灭菌体系的建立实验采用酒精和NaC10作为灭菌剂。对带芽茎段进行初步灭菌，用75%酒精浸润材料305后，迅速用无菌水冲洗4次，然后再分别用2%、3%、5%、10%的NaCIO溶液消毒smin，消毒结束后用无菌水冲洗4次。最后，将灭菌后的带芽茎段接种在MS培养基上，每种处理接种外植体10个，实验重复3次。IOd后观察统计，根据外植体的污染率、死亡率、成活率等指标筛选出最佳的外植体消毒灭菌体系。成活率=外植体数一污染率一死亡率

1.2.2不同植物生长调节剂对增殖的影响实验采用MS作为基本培养基，以细胞分裂素6一节基嘿吟(6一BA)和细胞生长素蔡乙酸(NAA)作为植物生长调节剂，共设6种处理(见表l)。将消毒后的带芽茎段置于增殖培养基中，对其进行不定芽诱导，每种处理接种10个外植体，3次重复。培养30d后，统计其增殖系数(接种后死亡茎段不计人其中)。

1.2.3不同基本培养基对生根的影响将增殖培养基中诱导出的不定芽进行切割分离，一部分继续留作增殖培养，一部分则切割成约1.5一2.ocm的带芽茎段接种于1/2MS和Ms两种基本生根培养基中，每种培养基都各加NAAlm梦L，每处理接种10个左右的外植体，重复3次。25d后统计生根率。

1.2.4不同生长素种类和浓度对生根的影响外植体的切取方法同

1.2.3，以1/2MS为基本培养基，每种培养基各加不同浓度的蔡乙酸(NAA)和叫噪丁酸(IBA)，共计6种处理组合(见表2)。每处理接种10个外植体，重复3次。20d后统计生根率(死亡、污染外植体不计人其中)。

1.3叶片不定芽再生体系的建立

1.3.1不同植物生长调节剂对诱导愈伤组织的影响

将微体繁殖中带芽茎段繁殖成功的无菌苗叶片切成0.somx0.scm左右的小块，作为叶片不定芽再生诱导的外植体，以MS作为基本培养基，将其置于添加了不同生长调节剂的培养基中。各种处理组合见表1。每处理6瓶，每瓶4个外植体。20d后统计其愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的叶片数/接种的叶片数x100%

1.3.2不同植物生长调节剂对不定芽分化的影响将养基中进行诱导，其中分化培养基以表1中1一4号6一BA和NAA处理组合为依据，每处理6瓶，每瓶4个外植体，20d后统计其分化率和分化系数(褐化，死亡的愈伤组织不计人其内)。分化率二分化的愈伤组织数/接种的愈伤组织数x100%分化系数=分化的不定芽数/分化的愈伤组织数xroo%培养基均添加7留L琼脂，25岁L蔗糖，PH为5.8一6.0，高压灭菌121℃20min，组培室的培养条件为室温(25土2)℃，空气相对湿度60%左右，每个培养架的光照由2根40W的直管型荧光灯管提供，强度为2000~3O00h左右，采用每日光培养16h和暗培养sh的光周期(6:ooam一10:oopm)。LS数据处理数据统计分析采用MierosoftExee一和sPss软件处理，多重比较采用LSD检验法。

2结果与分析

2.1离体快繁体系的建立

2.1.1带芽茎段最佳灭菌体系的建立用75%酒精对外植体进行灭菌不仅是对材料的初步消毒，而且酒精还可以浸润外植体的表面，这样就能够使NaCIO消毒剂更容易均匀地渗透到外植体表面上，杀死细菌和真菌。其中，合适的NaCIO的浓度是最佳灭菌体系建立的关键。在经过不同浓度的NaClo消毒smin后，分别进行lod的启动培养，即可统计污染率、死亡率和成活率。如图1所示，2%NaCIO消毒液处理后的外植体污染率较高，可达到40%以上，而其他3种浓度的消毒液污染率都维持在较低水平，不高于5%。另外，10%NaCIO的消毒液处理后外植体的死亡率较高，为60%左右，其次为2%的NaCIO消毒液。综合来看，不同浓度的NaC10消毒液外植体的成活率为3%>5%>lO%>2%。其中，3%和5%的成活率都较高，都大于90%且相差不大，是君白菊带芽茎段外植体较好的NaCIO消毒灭菌浓度。

2.1.2不同生长调节剂对带芽茎段增殖的影响将带芽茎段接种于增殖培养基后1一2d，腋芽迅速膨大萌发成幼嫩小叶片，95%以上的外植体都可以完成启动生长，3od左右完成增殖培养的过程。1个月以后，外植体随着培养时间的进一步增加和培养基营养的流失，长势开始出现衰退，叶片有枯黄、枯萎的现象。因此，应在1个月左右及时进行下一代的转接和增殖。在增殖生长过程中，细胞分裂素是细胞增殖中一种重要的调节激素，它与植物生长素共同配合影响增殖的进程和增殖系数。如表3所示，在6一BA和NAA不同激素处理组合中，带芽茎段的增殖系数达到3.5一5.5，其中最大的增殖系数为5.5，出现在处理3中，说明MS+3.Om梦L6一BA+0.sm留LNAA是君白菊带芽茎段最佳的增殖培养基。此外，通过对不同种植物生长调节剂的显著性比较可知，6一BA浓度为1.0、2.0、3.om梦L和4.0、5.0、6.Om梦L时，它们组内间的差异不显著，但两者之间差异显著，结合增殖系数可知，6一BA为1.0一3.0m妙浓度时对带芽茎段的增殖效果较好。同理可知，NAA浓度为0.5、一。、1.sm留L之间和0.1、0.2、o.sm留L之间时，它们组内间差异不显著，两者之间差异显著，0.1一0.5m梦L对带芽茎段增殖系数影响较大，最佳的NAA浓度水平为0.sm留L。2.2叶片不定芽再生体系的建立

2.2.1不同植物生长调节剂对诱导愈伤组织的影响叶片接种于表6的各种诱导培养基后15d，在叶片与培养基接触的地方开始有少量的愈伤组织生长，靠近叶柄的地方愈伤生长量较大。前期愈伤组织生长迅速，呈现黄绿色或淡绿色的颗粒状突起，愈伤组织很紧实，生长较好。经过1个月左右，愈伤组织生长缓慢，逐渐有部分愈伤呈现褐化的趋势，并趋于死亡。6一BA和NAA的各种组合均能较好的诱导出叶片的愈伤组织，其中处理2、4、5、6的愈伤诱导率可达到90%以上，不同种生长调节剂组合诱导的愈伤量有所不同，随着处理卜6细胞分裂素的增加，愈伤量逐渐增加。因此，通过对表6分析可知，诱导叶片愈伤组织的最佳培养基为处理4、5和6。

2.2.2不同生长调节剂对不定芽分化的影响将诱导的浅绿色、紧实、生长较好的愈伤组织接种于分化培养基10d后，部分愈伤组织开始进行不定芽分化。由表7可知，君白菊整体诱导分化率较低，大部分的愈伤组织都不能继续分化，最高分化诱导率的处理为3，即MS+3.06一BA+0.SNAA，诱导率为28.6%。此外，在实验中，愈伤组织分化率也较低，每块愈伤组织仅能诱导分化出1一2个不定芽，最高的分化系数为处理2，即MS+2.06一BA+0.2NAA，分化系数为2.3。3结论与讨论在植物离体培养中，诱导形态发生主要受培养基种类、植物生长调节剂以及植物基因型等因素影响l’一s]o王丽华、王永清等人在对菊花的组织培养进行研究时发现13一71，MS培养基是适宜菊类植物组织培养的基本培养基，因此本实验以MS作为君白菊的基本培养基，通过添加不同种类和浓度的植物生长调节剂来诱导植物形态发生，建立了君白菊的微体繁殖再生体系。实验选择幼嫩的带芽茎段作为外植体，建立了最佳灭菌体系:75%酒精305、无菌水冲洗4次、3%一5%NaCIO溶液浸润振荡smin，无菌水冲洗4次。通过对不同种植物生长调节剂浓度和配比比例的调节，筛选出了君白菊带芽茎段的最佳增殖培养基为MS+3.om彭L6一BA+0.5m留LNAA，最佳的生根培养基为1/2MS+1.0m叭IBA。

实验中通过IBA诱导出的根粗壮，生根率也较高，但有部分根是从愈伤组织中诱导出来，这样的根与试管苗联结性较差，不利于移栽成活，因此在后续的实验中应注重这一方面的研究。笔者在对君白菊叶片诱导分化再生体系进行初步的探索中，诱导出了生长良好的愈伤组织，诱导率可达90%以上，但将其继续诱导分化不定芽时，分化率和分化系数都较低，这一方面可能由于实验中处理组合不够全面和充分，未能找到合适的君自菊叶片诱导分化最佳植物生长调节剂组合，另一方面也可能由于植物自身的基因型所限阵”分化困难，其原因还有待进一步的实验和探讨。