细胞生物学实验教学初试分析

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摘要：为了使教学工作紧跟科学发展前沿与热点，该项实验引入DNA损伤修复内容，并使所提出的问题均具有开放性，旨在全方位锻炼学生的自主性与创新性，提高细胞生物学实验教学效果。

关键词：研究热点；学科问题；DNA损伤修复；创新性；自主性

实验教学是细胞生物学课程体系的重要组成部分，是对细胞生物学理论课程的重要支撑，有助于学生掌握理论基础知识，训练探索科学的方法，激发学习兴趣，培养手脑并用能力及实事求是的科学作风和严谨的科学态度。因此，不断改进实验教学方法和教学内容，是相关课程实验教学教师应长期关注和探讨的课题。进入21世纪以来，生命科学取得了巨大进步和迅速发展，已经成为自然科学的前沿学科。大量研究成果的出现及相关知识和信息的井喷式增长，不断地革新着我们对生命的理解和认识[1-4]。这些不断出现的新成果和新知识，不仅为生物学教学工作注入源源不断的素材，也是对教学工作者的挑战，只有及时更新和完善教学内容和教学方法，才能使教学工作跟上生命科学发展的步伐[5-7]。为了跟踪生命科学研究前沿，将当前生命科学研究热点引入课堂，将大大提升学生的学习积极性。笔者在细胞生物学实验教学内容中引入“DNA损伤修复实验”，取得了良好的教学成果。

1将科学研究热点与一流教学平台结合

DNA损伤修复是细胞内DNA分子在受到外源或内源损伤后，在多种蛋白共同作用下自我修复从而恢复结构的过程。DNA损伤修复研究对研究基因组不稳定性及肿瘤的发生与发展具有重要的指导意义，其中关键信号分子的靶向小分子药物研究，对于肿瘤治疗具有极其重要的临床意义。例如，在临床中运用PARP1抑制剂来抑制PARP1介导的DNA修复，对于肿瘤尤其是BRCA1/2基因突变引起的肿瘤，具有极好的治疗效果，已在临床上广泛使用[8-9]。由于DNA损伤修复研究在肿瘤研究和肿瘤治疗过程中具有重要作用，已成为各国重点投入的热点研究学科。2015年度诺贝尔化学奖授予托马斯•林道尔（TomasLindahl）、保罗•莫德里奇（PaulModrich）和阿奇兹•桑卡（AzizSancar），就是表彰他们在DNA修复机制方面的研究贡献。将DNA损伤修复研究引入细胞生物学实验教学，能够使学生切身体会和感受生命科学研究的前沿科学问题，激发他们探究生命奥秘的信心。我校生物学实验教学中心是我国首批建设的国家级实验教学示范中心，拥有一流的实验教学设备和实验教学队伍。在多年的教学过程中，中心改变了实验教学依附于理论课教学的模式，全面整合教学内容，强化基本实验技能训练，以能力培养为主线，重点培养学生的科学研究能力和科学思维能力，以及良好的科学研究素养。中心目前已建成多个综合型实验教学实验室，实验设备先进、功能齐全，除了完成基本教学任务外，已经具备供学生进行系统性科学实验探索的能力，是本项实验教学改革工作的坚实保障。

2教学改革目标

（1）培养学生提出问题和解决问题的能力。鉴于本项实验教学所提出的问题是开放性的，在课程前期主要是让学生按照教师提出的实验方法学习DNA损伤修复研究的主要手段。在学生理解相关的基本原理并掌握主要研究方法之后，重点引导学生自己寻找课题，解决关于DNA损伤修复方面的科学问题。这一学习过程有助于培养学生提出科学问题并用所学知识加以解决的能力。（2）在教学中添加研究元素。原有的细胞生物学实验教学主要是使学生了解和掌握一些经典的实验技术和手段，每个实验都相对独立。本项实验教学则使学生在掌握DNA损伤修复经典研究技术的基础上，能够解决一个自己感兴趣的科学问题。使学生由被动接受知识变为主动解决问题，提高学生的学习主动性和积极性。（3）引入细胞信号转导教学内容。目前，细胞信号转导研究是生命科学研究的热点，而原有实验教学基本不包括细胞信号转导方面的实验。本项实验教学将使学生直观感受细胞在受到损伤信号后所发生的变化，并检测DNA修复蛋白在DNA损伤位点的迁移及所形成的foci结构。

3实验设计

3.1实验原理。DNA损伤修复是指生物细胞内的DNA分子受到内源或者外源损伤后结构的恢复现象，是机体细胞内的多种酶和信号分子共同作用的结果。当DNA发生损伤时，组蛋白H2Ax的Ser139位点会被磷酸化修饰，并且会将DNA修复蛋白招募到细胞核内DNA的损伤位点，从而对DNA损伤进行修复。DNA损伤有多种形式，其中最为严重的一种是DNA双链断裂（DNAdoublestrandbreak,DSB）。DSB发生后，细胞需要快速采取措施停止或推迟细胞分裂，为DNA修复提供足够时间。真核细胞主要通过两种途径修复DSB：同源重组（homologuesrecombination，HR）和非同源末端链接（nonhomologuesendjoining，NHEJ）。其中，修复蛋白53BP1能够在DNA损伤发生后被快速招募到DNA损伤位点，从而介导NHEJ修复过程。DNA损伤诱导53BP1的招募，可以通过荧光显微镜进行观察，从而检测DNA损伤修复过程的发生[10-12]。3.2实验材料准备。HeLa细胞，2cm细胞培养皿，1.5cm细胞爬片，DMEM培养基，PBS，青霉素和链霉素，DAPI染料，荧光显微镜，载玻片，喜树碱（CPT），抗体，抗癌类药物或者小分子化合物。所需实验材料由学生决定，实验教学中心帮助解决。3.3实验步骤。（1）准备细胞（HeLacell），每个小组2位同学，准备3皿细胞（提前一天种细胞爬片，由教师负责）；（2）DNA损伤修复实验原理和研究前沿介绍（在普通实验室完成）；（3）在细胞无菌操作室将CPT或各自准备的化合物按照各组自行设计的方案加入细胞中；（4）将细胞培养皿交给教师，放置于细胞培养箱培养2h；（5）细胞培养皿用1mL的PBS洗3次，2min/次；（6）将0.3mL、4%的甲醛（用磷酸盐缓冲液PBS配置而成），室温孵育10min；（7）用1mL的PBS洗3次，2min/次；（8）用0.1%的TritonX-100（用PBS配置而成）在室温孵育5min，300µL/片（注意滴加在盖玻片上，下同）；（9）用1mL的PBS洗3次，2min/次；（10）用马血清（用细胞培养缓冲液PBST配置而成）在室温孵育15min，300µL/片；（11）一抗抗体1∶500稀释（用PBST配置而成），200µL/片，室温孵育1h；（12）用1mL的PBS洗3次，2min/次；（13）二抗抗体1∶100稀释（用PBST配置而成），200µL/片，室温孵育40min（此步骤及以后步骤均需要遮光处理）；（14）用1mL的PBST洗3次，1min/次；（15）将50%DAPI溶液（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole)+50%抗荧光淬灭封片剂）25µL滴于洁净载玻片，反扣；（16）在荧光显微镜下观察。3.4结果与分析。图1为CPT诱导细胞DNA损伤修复的观察，其中上、下两组分别为对照组和加入CPT的实验组，左侧为53BP1荧光显色图，右侧为DAPI核酸染色图。如图1所示，CPT处理HeLa细胞2h后，能够在荧光显微镜下观察到53BP1foci的形成，说明CPT对诱导细胞DNA损伤的形成具有很强的作用。在没有通过CPT处理的HeLa细胞中，部分细胞能够检测到53BP1foci的形成，说明在正常的细胞中，有源发性的DNA损伤发生。实验还检测了其他药物或化合物，发现很多化合物都不能促进DNA损伤修复的发生。实验还发现，大多数抗肿瘤药物都能引起细胞的凋亡或死亡，这些药物的副作用和药物作用特异性引起学生关注，激发了他们进一步探究的兴趣。在本项实验中，学生基本上都能顺利完成所有实验，取得了比较好的实验效果。但也有学生由于所加药物毒性太大，或药物浓度过高，导致细胞大量死亡，而无法获得较好的实验效果。今后将增加细胞药物耐受性检测，使学生能够在适当的药物浓度下进行实验，从而获得更好的教学效果。引入DNA修复实验，不仅让学生接触了学科前沿，而且使学生又一次得到无菌操作技术、免疫荧光技术训练，有助于学生更好地掌握细胞生物学基础实验技术，为未来读研或快速开展科研打好基础。

4结语

本次教学改革旨在锻炼学生自己提出问题、设计实验方案，并用经典的实验手段解决问题及对实验结果进行分析的能力，实现课堂教学与大学生创新科研训练培养一体化。同时，将最前沿的研究热点和科学问题带入课堂，能够使学生了解和设计相关研究项目，极大地提高了学生的课堂参与度与学习兴趣，获取了良好的教学效果。

作者:雷曹琦 谢志雄 李小燕 单位:武汉大学