胶体金免疫试验探析

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一、胶体金免疫结合试验的检测原理

胶体金免疫结合试验的检测原理是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合,再通过胶体金结合物达到检测目的。根据检测装置的不同可分为金免疫渗滤试验(GIFA)和金免疫层析试验(GICA)。

1·GIFA:GIFA始于1985年[1],最初以酶作为标记物。1989年发展了以胶体金为标记物用于检测艾滋病病毒抗体的渗滤试验[2],确立了GIFA的基本技术。GIFA试剂盒有2个主要成分:一是金标抗体结合物,另一是渗滤装置。该装置为一充满吸水垫料的塑料小盒,在盒盖中央的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜,膜上预包被抗原或抗体斑点。试验时将标本滴加在膜上,通过渗滤使抗原抗体在膜上发生免疫结合反应;再滴加金标结合物,使其与对应抗体抗原结合并显色。阳性结果在膜上出现着色斑点。

GIFA检测操作步骤与酶联免疫吸附试验(ELISA)法相同。差别在于加样、反应和洗涤均通过渗滤完成。检测全过程仅需数分钟,但敏感度却与需数小时完成的ELISA相仿。其原因在于:ELISA样品中的待检抗原需缓慢地扩散才能与吸附于固相表面的抗体反应,而在膜渗滤法中,抗体充满了膜的微孔,待检液体层层渗滤时抗原抗体紧密接触形成免疫浓缩,从而提高了反应效率。另外,以胶体金作为标记物,不但减少了操作步骤,而且试剂可在室温长期保存。

2·GICA:1990年Oskiowicz等[3]应用硒作为标记物建立了免疫层析试验。其后一般均采用简便的胶体金试验。其检测原理与GIFA相同,不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流,而是基于层析作用的横向流动。GICA是将各种反应试剂以条带状固定在同一试纸条上,待检标本加在试纸条的一端,将一种试剂溶解后,通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触,样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生特异性免疫反应。层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域(检测带),通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带,达到与结合标记物自动分离之目的。GICA特点是单一试剂,一步操作,全部试剂可在室温长期保存。这种新的方法将胶体金免疫检测试验推进到一个崭新的阶段。

二、GICA试剂的制作

1·试剂:为试纸条形式。在试纸条的塑料片上依次粘贴如下组分:(1)吸水纸(加样区),(2)玻璃纤维膜,膜上吸附着干燥的金标抗体(流动带),(3)硝酸纤维素膜,膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带(检测带),(4)吸水纸。以上各组份首尾互相衔接。因此在(1)处滴加液体标本,液流即向(4)处移动。当液体到达(2)处时,金标抗体被溶解,同时与标本中的抗原反应形成复合物。液流继续前移至(3)时,带有金标记的复合物被膜上的抗体捕获,呈现红色的线条。未结合的金标抗体继续前移至(4)处。

2·GICA制作中须注意的几个问题:GICA检测的可靠性主要依赖于所用试剂的质量。其中层析材料的选择、处理以及受体固定是免疫层析条研制的关键技术。微孔滤膜:层析反应是以滤膜为载体,所以滤膜的质量致关重要。其吸附性能、过滤速度等均会影响检测结果。有些滤膜很难达到各部分性质均一的质量,因此,应仔细筛选优质滤膜。可选择的滤膜除硝酸纤维膜外还有尼龙膜、羧化纤维素膜、聚酯膜、纯纤维素膜和玻璃纤维膜等多种类型,但硝酸纤维素膜(NCM)运用较多。这主要得益于NCM的2个特性:较高的蛋白吸附容量和良好的亲水性。纯纤维素膜和羧化纤维素膜也是免疫层析的常用材料,但一般要求预先对其作化学处理,使其具有与受体蛋白共价联接的特性。

常用的处理方法有苯醌法[4]、溴化氰法[5]和碳二亚胺法[6]。受体:固定于滤膜的受体要求具备如下几点性质:(1)与膜材料的结合稳定性好;(2)有较高的生物活性,因而有足够的配体捕获容量;(3)有较高的纯度,此为特异性检测的基础;(4)对于以干态吸附于流动带的标记或非标记受体,其可流动性是评价其性能优劣的主要指标。往往要求在流动带加入高效助溶剂,从而使吸附于流动带的受体具有快速溶解的特性。受体固定工艺:受体固定工艺应简单、有效。如大规模生产应采用机械喷膜,保证制膜快速、稳定、一致。受体包被量:筛选最佳的受体包被量是提高检测敏感度的重要因素之一。在不影响所需灵敏度的前提下可提高固相抗原或抗体的浓度,扩展测定的线性范围,以减少钩状效应。

另外,有些检测项目如血清肌红蛋白、肌钙蛋白和甲胎蛋白等阳性质控的阈值高低与检测的敏感性和特异性密切相关。这类检测的质控受体包被量还需解决具有临床诊断意义的“检测下限”即阴性或阳性分界的临界值问题。包被滤膜剩余吸附位点的有效封闭:除上述几点外,与此相关的其他内容如筛选和纯化抗体、制备标记物和确定标记物工作液浓度以及选择助溶剂等,也是不容忽视的重要环节。

三、胶体金免疫结合试验的应用

胶体金免疫结合试验可应用于免疫学检测的所有方面。但主要用于检测正常体液中不存在的抗原性物质(如诊断传染病中的抗原或抗体),以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质(如HCG、甲胎蛋白、C-反应蛋白等)。近年来由于制备技术的改进和试剂原料的提高,应用范围更加广阔。现国内外有商品供应及文献报道的检测项目有:

1·激素:应用最广的首推尿液检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的早早孕诊断试剂。妇女受孕后10d,即预期月经前2~4d,即可呈现阳性反应。还有促黄体生成激素(LH)和促卵泡成熟激素(FSH)等。

2·传染病病原的抗原和抗体:(1)肝炎病毒:甲型肝炎IgM抗体(抗HAV-IgM)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗体(抗HBc-IgM、IgG)和丙型肝炎抗体(抗HCV)等。(2)其他病毒:艾滋病病毒抗体(抗HIV)、肾综合征出血热病毒抗体、乙型脑炎血清特异性抗体、传染性单核细胞症嗜酸性抗体、单纯疱疹病毒抗体、巨细胞病毒抗体、风疹病毒抗体、轮状病毒(粪便)、登革热病毒抗体、呼吸道合胞病毒(分泌物)和流感病毒A抗原(鼻咽部分泌物)等。

3·性病病原:梅毒螺旋体抗体、淋球菌(分泌物)和泌尿生殖系沙眼衣原体(分泌物)等。

4·细菌:结核杆菌抗体、A族乙型溶血性链球菌(喉拭标本)、沙门菌血清抗体和与慢性胃炎、消化道溃疡密切相关且可能是胃癌发病的危险因素的胃幽门螺杆菌抗体等。

5·寄生虫:弓形虫抗体、包虫体抗体、血吸虫抗体、人囊虫病、恶性疟原虫循环抗原和间日疟原虫、班氏丝虫抗原及利什曼原虫抗原等。

6·肿瘤标记物:前列腺癌特异抗原(PSA);对消化道恶性肿瘤尤其是结肠癌有较高的诊断价值,并对辅助诊断胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等也有重要意义的血清癌胚抗原(CEA);以及对肝癌的诊断有较高价值的甲胎蛋白(AFP);绒毛膜促性腺激素(HCG)还可对滋养层细胞肿瘤(葡萄胎、恶性葡萄胎、绒毛膜上皮癌等)具有诊断意义。

7·心血管病检测标志物:血清心肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶的测定对急性心肌梗塞的诊断极为有利。

8·其他蛋白质:对临床诊断消化道出血和普查筛选消化道肿瘤的重要检测项目大便潜血(FOB);和对系统性红斑狼疮的诊断及临床病情判断意义较大的抗双链DNA抗体;C反应蛋白(CRP);尿白蛋白和对桥本甲状腺炎的诊断有重要意义的甲状腺微粒体抗体等。

9·其他:检测血糖、尿糖;及检测尿液中其他小分子物质的试剂有苯丙胺、可卡因、大麻、吗啡和海洛因等。

四、胶体金免疫结合试验的应用展望

1·进一步提高检测灵敏度。灵敏度的提高无疑会拓宽金免疫结合试验的检测范围,而采用信号放大系统如生物素亲和素系统[7]或免疫金银染色法进行银加强[8],并结合一些相应的简单检测仪器可能是最有希望的途径之一。

2·实现检测多元化。可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定2种方式。一次检测可同时得到一组结果,这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。如HBsAg、艾滋病病毒抗体和抗原以及抗HCV的检测组合对献血者检查更为方便。同时检测抗弓形体、抗巨细胞病毒和抗风疹病毒等的抗体在围产期检查中极为有用。

3·实现定量或半定量检测。(1)根据显色强度应用简单仪器进行定量:GIFA可用反射光密度计对斑点颜色的强度进行测定,可得到半定量的结果。(2)控制受体捕获量:应用多种不同灵敏度受体固定量的方式,通过观察各自显色情况,将待测物含量确定于某一浓度区间,以实现半定量检测。

4·通用试剂的应用。(1)在间接法检测中用胶体金标记葡萄球菌蛋白A代替抗人IgG标记物,用于各种抗体的检测[9]。有利于减少非特异性反应,稳定检测试剂的质量。(2)链亲和素固定滤膜检测带可作为通用固定受体,与各种生物素化抗体结合用于检测相应的抗原性物质。由于链亲和素的四价性使其固定于膜材料后,仍能对生物素化抗体保持较高的反应活性,而且两者的结合具有高度的稳定性。