透析灵芝代谢产物对肿瘤细胞的作用

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摘要：目的了解灵芝代谢产物对肿瘤细胞的作用。方法①体质量为18～22g昆明140只小鼠随机分为7组，其中6组左前腋皮下注射S180，然后分别给予生理盐水、腹腔注射含灵芝代谢产物培养基、环磷酰胺、腹腔注射含灵芝代谢产物培养基加抗血清组、口服含灵芝代谢产物培养基组和单纯腹腔注射抗血清组处理，未注射S180的20只给予生理盐水，一周后处死各组动物观察各组肿瘤质量大小、血清TNF-α水平、血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶变化。结果腹腔注射含灵芝代谢产物培养基加抗血清组能有效减轻荷瘤小鼠的肿瘤质量，其质量减轻程度与环磷酰胺无差异。结论灵芝代谢产物中的羟基可能参与了抗肿瘤作用。

关键词：灵芝代谢产物；TNF-α；肿瘤；羟基

灵芝是我国医学宝库中的灵芝属药、食两用真菌。其在自然界生长过程中必然要与细菌等自然界其他微生物争夺营养，而灵芝作为一种真菌，生长速度要远慢于细菌，所以作为灵芝能获胜的法宝之一可能就是其代谢产物，而真菌代谢产物的开发早已被证明是非常有价值的，比如历史上青霉素的发现就是例证，在这方面我国的发展步伐却比较慢，灵芝代谢产物药理作用的开发也将丰富我国中药的用途。对于灵芝代谢产物的研究目前并不多而且主要集中在其中灵芝多糖的测定上［1］。但灵芝的代谢产物是否能够对肿瘤细胞有所作用？为解决这个问题，我们进行了如下实验。

1材料与仪器

1.1试剂环磷酰胺（CTX）注射液由上海华联制药有限公司生产（生产批号为071002）。TNF-αELISA试剂盒购于渤海生物公司。肝功能检测试剂盒购于上海荣盛公司。

1.2含灵芝的代谢产物培养基取生长于斜面固体培养基上的灵芝菌泥（约1cm2）接种于100ml液体培养基（含2%黄豆粉，2%蔗糖，0.075%的磷酸二氢钾，0.03%的硫酸镁），25℃100r/min条件下培养5d，用滤纸过滤后得到含灵芝的代谢产物培养基。将这些培养基在-20℃条件下保存待用。

1.3抗血清制备使用李丽华等［2，3］报道的琥珀酸酐法将含灵芝的代谢产物培养基中所有成分的羟基与小牛血清白蛋白（BSA）连接。使用连接后的化合物免疫昆明小鼠，制备抗血清。经琼脂双向扩散法测定该抗血清的效价是1∶16。

1.4肿瘤细胞株S180购自河北医科大学动物中心。

1.5动物昆明小鼠(由河北医科大学动物中心提供)146只，体质量为18～22g，雌雄各半。

1.6仪器微量加样器（SOCOREX，瑞士）；电热恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司），离心机（国产），Humalyzer2000型全自动生化仪，德国豪迈公司生产等。

2方法

2.1建立肿瘤模型选择6只昆明小鼠腹腔接种S180，接种5d后的小鼠，消毒腹部皮肤，用无菌空针抽吸腹水放入无菌容器内，置冰块保存。用0.4%台盼蓝染色后计数，在倒置式显微镜下计数，计算存活率，，用Hank''''s液稀释细胞悬液使活细胞数达到1×109个?ml-1，随机选取120小鼠，每只小鼠左前腋皮下注射0.2ml（活细胞数达到1×109个?ml-1）细胞悬液，另外20只小鼠不做任何处理作为正常组。

2.2动物分组将120只已经注射了S180的小鼠随机分为6组，每组动物各20只，分为阴性对照组、腹腔注射含灵芝代谢产物培养基组（注射产物组）、环磷酰胺（CTX）组、腹腔注射含灵芝代谢产物培养基加抗血清组（注射产物加血清组）、口服含灵芝代谢产物培养基组（口服产物组）和抗血清组。阴性对照组和正常组胃饲生理盐水0.2ml/（kg?d）；环磷酰胺组腹腔注射环磷酰氨0.075g/（kg?d）；腹腔注射含灵芝代谢产物培养基组给予腹腔注射灵芝代谢产物2ml/（kg?d），抗血清组给予腹腔注射抗血清2ml/（kg?d），腹腔注射含灵芝代谢产物培养基加抗血清组给予腹腔注射灵芝代谢产物2ml/（kg?d）同时腹腔注射抗血清2ml/（kg?d），口服含灵芝代谢产物培养基组给予口服含灵芝代谢产物培养基2ml/（kg?d）。

2.3动物处理以上各组在接瘤24h后开始给药，连续给药7d后，处死动物，取出肿瘤和肝脏，用电子天平称出肿瘤质量。同时取血放入肝素抗凝素管内分离血清备用。

2.4ELISA法测定各组血清TNF-α水平应用TNF-αELISA试剂盒（购于渤海生物公司）按说明书测定保存血清中的TNF-α水平。

2.5使用全自动生化分析仪测定测量血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)。

2.6统计学方法均采用SPSS10.0软件，进行t检验。

3结果

3.1各组肿瘤质量如表1所示，阴性对照组与抗血清组肿瘤质量无差异（P＞0.05）；注射产物与血清组和环磷酰胺组无差异（P＞0.05）；阴性对照组与所有组均有差异（P＜0.05）；注射产物组与口服产物组有差异（P＜0.05），注射产物组与口服产物组有差异（P＜0.05）。

3.2各组血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT）如表1所示，谷草转氨酶(AST)的结果中只有正常组与其他组有差异（P＜0.05），其余各组间谷草转氨酶(AST)的结果均无差异；谷丙转氨酶(ALT)的结果中只有正常组与其他组有差异（P＜0.05），口服产物组、环磷酰胺组与注射产物与血清组之间无差异（P＞0.05）；环磷酰胺与注射产物组有差异（P＜0.05），口服产物组与阴性对照组有差异（P＜0.05）。

3.3TNF-α水平如表1所示，环磷酰胺组TNF-α的水平与注射产物与血清组之间无差异（P＞0.05），正常组、阴性对照组与血清组无差异（P＞0.05），环磷酰胺组与阴性对照组有差异（P＜0.05）；注射产物与血清组与阴性组有差异（P＜0.05）。表1各组肿瘤质量、肝功能和细胞因子水平（略）

4讨论

有的文献报道［4，5］灵芝具有对抗肿瘤的作用，这次实验结果显示，含灵芝代谢产物的培养液也具有抗肿瘤的作用，在我们的实验结果中不论口服与腹腔注射含灵芝代谢产物的培养液肿瘤的质量均缩小，其结果具有统计学差异。但作为阳性组的环磷酰胺组其肿瘤的质量要小于口服含灵芝代谢产物的培养液组，这说明可能经口服后存在首关消除，而肝功能的指标也显示口服含灵芝代谢产物的培养液组的谷丙转氨酶要低于阴性对照组和正常组。而在培养液中到底是何种化学集团起到抗肿瘤作用呢？我们根据刘文泰等人报道的琥珀酸酐法用小牛血清白蛋白封闭了代谢产物中的羟基后，用它作为免疫原免疫老鼠产生对抗除羟基外其他化学集团的抗血清，我们用这些抗血清封闭了含灵芝代谢产物的培养液的其他化学集团，只保留了部分羟基，实验结果显示用抗血清封闭的含灵芝代谢产物的培养液的抗肿瘤活性增强，这说明可能灵芝代谢产物中的羟基在对于抗肿瘤起了很大作用。而腹腔注射的作用强于口服的作用说明，这些代谢产物中的羟基可以被肝脏清除。

我们的结果还显示同时含灵芝代谢产物的培养液与抗血清组与注射环磷酰胺组的小鼠血清TNF-α水平都很高。而环磷酰胺对肿瘤细胞有直接的杀伤作用，而这些死亡的肿瘤细胞可能刺激了小鼠血清TNF-α水平的升高。而同时含灵芝代谢产物的培养液与抗血清组的TNF-α水平也同样升高说明，这些灵芝代谢产物中可能有直接杀伤肿瘤细胞的物质存在。

参考文献：

［1］单卫华，张玲，时延增，等．灵芝菌发酵液制剂中灵芝多糖及总糖含量测定［J］．时珍国医国药，2000，11（9）：797.

［2］李丽华，刘文泰．抗中药成分的特异性抗体在中药质量检测中的应用探讨［J］．中国中医基础理论杂志，2008，14（9）：686.

［3］YamazakiM，SatoA，SaitoK，etal.MolecularphylogenybasedonRFLPanditsrelationwithalkaloidpatternsinLupinusplants［J］．BiolPharmBull，1993，16(2):1182.

［4］刘高强，王晓玲．灵芝多糖的抗癌构效关系及其抗癌作用机制［J］．菌物学报，2006，25（3）：430.

［5］吴珍珠．灵芝孢子抗肿瘤的作用机制［J］．细胞与分子免疫学杂志，2006，22(6)：836.