中医证候基因芯片研究论文

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【摘要】用现代科学技术研究中医证候是中医研究的重要课题。文章简要介绍了用基因芯片探讨中医证候本质的研究近况，主要包括肾阳虚证、虚寒证、心阳虚证、肺虚证、脾虚证和寒热证差异基因表达谱的研究，从而为从基因水平上阐释中医证候的本质特征和进一步建立中医证候的基因组学做了有意义的探索。

【关键词】中医证候基因芯片生命科学

近年生命科学最热门的三大领域是基因组研究、细胞凋亡和细胞信号转导。相应地也有三大生物技术给予支持，这就是DNA测序、PCR技术和生物芯片技术。自1991年美国加州旧金山Affymetrix公司创造了世界上第一块DNA芯片、1995年Stanford大学发表第一篇基因表达芯片文章以来，基因芯片技术已广泛地被用于基因功能的研究［1］。基因芯片是生物芯片中应用最广泛、技术最成熟的分支，又叫DNA芯片、DNA微阵列，其是在面积不大的基片表面上以点阵的方式有序排列一系列固定于一定位置的可寻址的识别分子（DNA和RN段），并以此作为探针，在一定条件下与样品待测的靶基因片段进行结合或反应，反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示，然后用精密的扫描仪扫描记录，通过计算机软件分析，综合可读信息，最终实现对靶基因的存在、含量及变异等信息的快速检测。

1中医证候及其证候基因组

辨证论治是中医学理论的特点之一，论治取决于辨证。中医的“证”是生命物质在疾病过程中具有时相性的本质反映。“候”的原意则是用以说明事物变化的情状，即所谓的疾病的临床表现。由于中医学对于疾病的认识侧重于整体、宏观、司外揣内，重视疾病某阶段机体的整体状态，辨证论治也即是通过对疾病表现在外的征象，进而推测演绎疾病的病因、病性和病位，由此归纳出证的概念［2］。用现代科技研究中医“证候”是中医研究的重要课题，证候病机及其与疾病和方剂的相关性是证候研究的重要科学问题［3］。中医证候是中医药研究的核心，“证候”本质的研究是中医现代化研究的热点和难点，如能获得突破性进展，必将使中医理论研究取得质的飞跃。应用现代医学理论和分子生物学技术阐明中医“证候”本质是实现中医药现代化的基础和关键，具有重大科学意义。中医“证候”本质研究虽经历几十年至今未能实质性突破，其根本原因在于以前没有一种像基因芯片那样十分有效地研究手段能同时检测许多机体、组织和细胞的变化，并比较变化以识别其规律［4］。中医证候的现代研究从以症状、疾病、组织、细胞等为主体，逐渐发展至分子水平、基因水平，并已由单个基因向多基因，由个别基因向基因组发展，由个别基因研究积累到研究基因表达谱，当今在引入基因芯片技术后，建立起证候的功能基因组表达谱［5］，旨在寻找一些与证候相关的基因，然后根据这些基因与证候的关系密切程度用于证候的基因诊断和疗效评价［6］。从中医理论看，证候的形成是由先天的体质因素和后天的环境因素共同作用的结果，因而对证候的研究可能要绘制3张图谱：基因组图谱、单核苷多态性（SNP）图谱和蛋白质组学图谱。而SNP谱体现了不同人种和同一人种不同个体之间的基因组差异，并决定人类个体体质差异和疾病易感性，也可能是中医禀赋学说的基因组背景。

2中医证候的基因芯片研究

2.1肾阳虚证

倪红梅等［7］对肾阳虚体质青少年差异表达基因的基因芯片研究，选取上海16～24岁青少年154例进行肾阳虚体质筛查，筛查出6例肾阳虚体质者，男性1例，女性5例，余148例为对照，分别采集两组的外周血，分离白细胞并抽提RNA。基因芯片采用上海博星公司的H80S型，可做人标本的8465点杂交,结果筛选出127条差异基因，其中63条上调基因，64条下调基因，其涉及免疫相关、细胞周期蛋白、发育相关、细胞生长、细胞凋亡相关蛋白、代谢、离子通道、转运蛋白、转录因子，以及信号转导系统。由此说明体质的本质是人体防御免疫功能、自我代偿修复和自我调节的反映，其物质基础是建立在人体各系统形态、机能及代谢活动之上的，其内在机理也是多系统多环节的。谭从娥等［8］对筛选出1例骨关节炎（OA）肾阳虚证行温针治疗（取穴：气海、关元、足三里、内外膝眼、阳陵泉），于治疗前后采集其外周血，做白细胞RNA抽提，以基因芯片研究其治疗前后的基因表达谱。结果：在70条差异表达基因中，上调基因49条，下调基因21条，并对34条基因初步分类分析：与免疫相关基因10条，主要表现为上调。如退火素A1基因（NM-000700），OA早期一些患者滑膜液中可有T细胞浸润，OA晚期某些细胞因子（IL-1,TNF-α）参与局部组织损伤，其与炎症免疫和自身免疫发生有关，致使关节软骨发生退行性变，故认为温针治疗后，免疫相关基因上调，提示温针治疗后可通过调节机体的免疫反应来干预OA的发病过程,还有热休克90KDβ链蛋白1基因（NM-007355）与基础代谢相关的基因5条,如II型cAMP依赖性调节蛋白酶β链基因(NM-002736),经针刺后上调了2.43倍,已知cAMP为调节新陈代谢的第二信使，其受cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)调节，可诱导蛋白质酶，加速新陈代谢，升高体温，调节机体能量平衡。提示温针可调节与基础代谢相关基因表达来改善患者基础代谢低的临床症状。与肌肉运动相关的基因5条,主要为下调基因,如胆碱能受体、烟碱性、α多肽1基因（NM-000079），此基因是突触内神经信息传递的基础，与骨骼肌运动、肌肉收缩直接相关。与生长发育相关基因9条，人体各组织均有转化生长因子β（TGFβ）诱导早期生长反应基因（NM-005655），上调了2.8倍，其可调节细胞生长分化。与信息相关的基因5条，主要表现为下调，如G蛋白信号调节因子1（RGS1）基因（NM-002922）下调了0.35倍，其是G蛋白结合受体复合物的重要调节和组成部分。温针可促进气血流通，使机体协调，起到全身调节作用。杨丽萍等［9］也以温针治疗肾阳虚骨关节炎,筛选出与免疫相关基因,其中上调基因5条,下调基因4条,上调基因主要有NCF1基因和CCR7基因,前者编码嗜中性细胞因子,后者编码G蛋白受体家族成员-趋化因子受体7。温针治疗下调基因CD97,其编码一个EGF-TM7家族成员,并存在于大部分活化的白细胞表面的糖蛋白,有G蛋白偶联特征。陈晓玲等［10］对一个典型的肾阳虚家系15个成员,以寡核苷酸杂交技术对其外周血单核细胞的差异表达谱分析研究,同时对血样本进行血液生化、免疫指标检测,还设正常人10人作为对照,比较二者结果。尽管存在普遍的血液生化与免疫学指标异常,但该肾阳虚寒证家族患者作为一个典型的阳虚寒证抽样,经统计学处理均未见显著性差异。此提示检测众多血液生化、免疫指标,对整体性失调的证侯群,其临床意义不大,故作为西医临床诊断所依仗的血液生化与免疫学指标,在诸如肾阳虚寒证等中医证的诊断方面,参考意义不明显。用5张北京博奥生物芯片中心生产的人全基因组表达谱芯片(2200个杂交点),来研究肾阳虚患者外周血红细胞基因表达谱,结果:①典型肾阳虚证/正常对照组:上调基因100条,下调基因33条;②肾阳虚证/正常对照组:上调基因148条,下调基因31条;③典型肾阳虚证治疗显效者治疗前/治疗后:上调基因12条,下调基因47条;④典型肾阳虚证/正常配偶:上调基因66条,下调基因44条。这些基因主要为：物质代谢、信号转导、能量代谢和免疫调节等,初步反映出肾阳虚证患者恶寒喜暖、肢冷倦卧、面色白等宏观证候在微观基因表达的分子生物学基础。

2.2虚寒证

为了研究虚寒证与能量代谢的关系，陆明等［11］分别在四川和陕西选择临床较常见的虚寒证肢冷患者10例和4例，前者温针治疗（取穴同谭从娥等［8］）14d后，与对照组比较及治疗前后自身比较，结果在4张芯片中患者1，2，3，4的差异表达基因分别为41条、246条、57条和70条。后者以有明显肢冷者为实验组，无肢冷者为对照组，比较二者，结果差异表达基因101条。在5张芯片中，共有重复差异表达基因30条，可查库基因19条，其中与能量代谢相关基因占21.43%，说明肢冷与新陈代谢密切相关。吴斌等［12］对一虚寒证典型家系（3代16人）筛选出虚寒证患者5人作为实验组，正常人5人做对照组，采集其外周血，抽提其细胞RNA行基因芯片检测，芯片采用上海博星公司的BiostarH-40ScDNA表达谱芯片。结果：筛选出差异基因79条，主要有与新陈代谢有关的基因占56.04％，与细胞生理过程有关的占40.66％，与细胞信号转导有关的占29.67%,与生物的生理过程有关的占15.38%,表明虚寒证集中于代谢基因的异常表达。另外，还涉及15条路径：其中人脂蛋白酶mRNA(Hs.180878)明显低表达，其主要功能为水解循环乳糜微粒的三酰甘油和极低密度脂蛋白，涉及了脂肪代谢路径。为研究OA虚寒证的基因表达谱，选择患者8例，同时选8例正常人为对照，采血提取细胞mRNA以北京博奥公司的22000点基因芯片检测,结果筛选出差异表达基因75条,其中上调基因23条,下调基因52条［13］。研究发现与免疫相关基因7条如与严重OA的自身免疫机制密切相关的中性粒细胞因子1基因（NM-000265），可促使免疫细胞穿过外周组织并进入次级淋巴器官的趋化因子受体7基因（NM-001838），与免疫抑制相关的环孢素B受体基因（NM-000942）等。还有调节软骨细胞生长分化的生长因子相关基因4，如转化生长因子β、胰岛素样生长因子等，其参与细胞的有丝分裂，促进软骨细胞增殖、分化和合成软骨基质。如调节细胞生长和分化的早期关键生长反应因子3基因（NM-004430），激活转化生长因子（TGF-β1）的早期生长反应因子1基因（NM-001964）,具有抑制表皮生长因子受体并在其溶酶体降解中具有重要作用的选择性连接蛋白（NM-003100）等。还有Ras诱导衰老因子基因（AF438313）上调。与能量代谢低下相关基因5条，如构成线粒体、呼吸链结构的线粒体ATP合成酶运输H＋的F1复合体亚家族基因（NM-001697）GTP酶激活蛋白的G蛋白信号调节因子2基因（NM-002923）等。由肾主骨、藏精气、主生长发育，故OA发病与肾虚有密切关系，而肾虚时亦可出现一系列生长发育相关基因表达异常。王米渠等［14］对寒证基因芯片的检测数据提出了分析方法：①纵向发展的聚类分析（个体用药后的连续追踪，进而研究家系寒证）；②横向互比的聚类分析（利用树状分层图等分析有关证候的调查数据）；③分证候的聚类分析（如肢冷单个证候的疗效分析）；④合寒证聚类分析（研究寒证证候变异主因素及其主效基因组之关系）。杨丽萍等［15］也对上述家系进一步做了能量代谢相关基因异常表达的探讨，结果涉及新陈代谢基因达70.73％。

2.3心阳虚证

用基因芯片探讨冠心病心阳虚证特征性基因表达谱，各采集5例患者和正常人外周血，抽提白细胞RNA行基因芯片检测，并对5例患者做温阳通痹治疗，1例显效，比较这1例治疗前后差异基因表达。结果：5例患者与正常人比较，差异表达基因231条，其与典型患者（1例）治疗前后的基因芯片差异基因谱中有39条差异基因表达一致，两条差异基因表达相异。说明这39条基因的差异表达可能是冠心病心阳虚证发生的分子生物学基础。差异基因的功能分析表明：主要涉及代谢、细胞发育、分化相关和免疫应答相关基因，部分阐释了冠心病心阳虚证的病理机制［16］。

2.4肺虚证

对慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺气虚和肺阴虚患者各4例及正常人4例采集其外周血，抽提淋巴细胞RNA行基因芯片检测。结果筛选出肺气虚/正常人45条差异表达基因，其中41条基因上调，4条基因下调；肺气虚/肺阴虚差异表达基因43条，其中上调基因27条，下调基因16条。主要涉及免疫相关基因和酶相关基因。由此可见，肺气虚证实质主要是与免疫相关基因表达谱的改变［17，18］。

2.5脾虚证应用基因芯片技术研究利血平脾虚证大鼠模型大脑皮层基因表达谱的改变，选取雌性的Wistar大鼠30只，分为造模组和对照组。造模组用利血平注射液背部皮下注射，于第14天处死，取大脑皮层，抽提mRNA行基因芯片检测，结果筛选出差异表达基因145条，占检测基因的3.54％。在已知的47条基因中,11条与免疫、应激和炎症反应有关，7条与能量代谢有关,与信号转导/转录有关和与细胞生长和分化有关的各为6条,5条与蛋白质合成有关，各为3条的是与DNA合成、修复有关的，与神经退行性疾病有关的，与神经递质传递和释放有关的基因，两条基因与离子通道和转运体有关的基因［19］。用4张基因芯片探讨脾气虚证免疫相关基因组学机制，选择脾气虚证慢性胃炎和溃疡性结肠炎病例及正常人各3例，分别采集其外周血，提取白细胞RNA行基因芯片检测，结果慢性胃炎脾气虚证和溃疡性结肠炎脾气虚证异常表达的免疫相关基因分别为68条和57条，二者相同的差异表达基因为7条，主要是与免疫相关的基因。提示脾气虚证发生有其免疫相关基因组学基础，是细胞免疫、体液免疫以及非特异性免疫功能等方面发生功能紊乱［20］。

2.6寒热证

2.6.1类风湿性关节炎（RA）在33例RA患者中探讨活动期和非活动期RA寒热证候的基因表达差异，分别采集患者和正常人静脉血，纯化得CD4＋T淋巴细胞，用基因芯片进行检测。结果筛选出活动期和稳定期差别基因63条，主要涉及免疫应答，稳定期RA寒热证患者筛选出48条差异基因，只有4条基因与上述63条基因重复，活动期RA寒热证有59条差异基因，但与上述基因不重复，二期均主要涉及功能代谢基因。提示RA患者稳定期和活动期的表达基因差异与寒热证候的基因表达差异不一致。说明RA分期与中医寒热证候分类都有各自的基因组学基础［21］。在这些病例中还进行了RA类风湿因子（RF）阴性和阳性与其寒热证分类的比较，结果RF阴性和阳性间有55条基因表达差异，主要涉及免疫应答；RF阳性和RF阴性RA寒热证患者各有71条和70条基因异常表达，前者主要涉及功能代谢和免疫应答，后者主要涉及功能代谢，与上述55条基因无重复，但与前者71条基因有两条基因重复。说明以RF阳性和阴性分型与中医寒热证分类的基因表达并不一致，都有各自的基因组学基础［22］。同样还有以RA早期和非早期差异基因与正常人基因表达比较，结果RA早期和非早期患者外周血CD4+T淋巴细胞基因表达存在明显差异,与正常人比较的差异基因与RA早期和非早期比较的差异基因不一致［23］。在5例活动期RA患者和3例正常人间比较RA患者外周血单核细胞基因表达差异,结果筛选出差异表达基因151条,主要涉及炎症/免疫反应,特别是与IgG及其免疫复合物结合的Fc受体(FcγR)高表达,其与RA初始阶段炎症激活及其后的炎症级联反应、慢性持续性炎症和关节破坏密切相关［24］。

2.6.2系统性红斑狼疮（SLE）对4例热毒炽盛型、5例阴虚内热型的SLE患者和6例正常人采集外周血，抽提白细胞RNA行基因芯片（7500余杂交点）检测，结果：筛选出差异表达基因89条，其中上调基因45条，下调44条，涉及细胞因子及其受体相关基因、免疫相关基因、信号传导和传递蛋白、离子通道和转运蛋白、蛋白翻译合成等。总的表达模式为免疫细胞对干扰素应答增高，免疫细胞蛋白质合成受抑，诱导细胞凋亡增加等。9张芯片的聚类分析表明，4例热毒炽盛型和5例阴虚内热型患者各归为一类。前者处于SLE中、重度活动期，其代谢相关基因、急性时相炎症反应相关基因表达水平明显高于后者［25］，尽管不同患者存在个体差异［26］。

基因芯片研究是全景式研究，使人们从整个细胞的角度观察已知基因在研究者设立的条件下整体表达情况，其与其他分子生物学方法结合起来将会使研究更广阔［27］。中医擅长宏观的整体性功能调节，而在微观其也是从整体上调节对立双方的基因功能，亦即从修饰或改变基因的表达与基因产物的功能着手，而不是改变与纠正基因的结构［28］。问题的关键是要找出不同证候的具有特征意义的差异表达基因，基因芯片技术为此提供了有力的工具。

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