神经源性疼痛实验模型研究论文

时间:2022-07-18 08:31:00

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神经源性疼痛实验模型研究论文

【摘要】神经源性疼痛是严重困扰人类的临床问题之一。为了探索其发病机理及治疗方法,研究人员建立了多种神经损伤性疼痛模型,其中大鼠部分脊神经结扎,慢性压迫性神经损伤和L5/L6脊神经结扎的外周神经损伤的模型应用最为广泛。细胞模型也显示出了很好的应用前景,原代和永久性感觉神经元,作为研究疼痛发生和发展的分子机理,特别是神经递质的释放和信号转导的研究非常有用。

【关键词】外周神经源性疼痛模型动物模型细胞

AnimalandCellularModelsofPeripheralNeuropathicPain

LIANGYingxia,CHENNian,ZHAOShunjin

(1.GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China;

2.ZhongshanSchoolofMedicine,SunYatsenUniversity,Guangzhou510080,China)

【Abstract】Peripheralneuropathicpainisoftendifficulttobeadequatelytreatedincurrentmedicine.Animalmodelsmayprovidepivotalsystemsforpreclinicalstudyofpain.Partialspinalligation,chronicconstrictioninjury,andL5/L6spinalnerveligationrepresentthreeofthebestcharacteristicrodentmodelsofperipheralneuropathy.Recently,primaryorpermanentculturesofsensoryneuronshavebeenestablishedtostudythemolecularmechanismofpain,especiallyforneurotransmitterreleaseandsignaltransduction.

【Keywords】Peripheralneuropathicpain;Model,animal;Model,cellular

外周神经源性疼痛是由于外周神经损伤、压迫、神经毒性、感染、免疫、代谢性疾病、肿瘤、维生素缺乏或其他原因引起的复杂的神经性疼痛。多种动物模型能够模拟人类外周神经源性疼痛,其中大部分是通过坐骨神经产生,不同之处在于对坐骨神经损伤的部位和程度不同,后者包括横断,松弛和紧结扎,压榨,完全或部分结扎、低温冻伤、炎性物质和肿瘤浸润等。动物模型缺点在于接受伤害性刺激时,无法用语言表达他们的疼痛程度,因此对各种异常行为的观察及正确分析成为动物模型的关键,通过观察反射性缩足、逃走、躲避、体位异常(包括后爪悬空不与地面接触或仅以未损伤区足跟或足内侧站立)、自噬、舔咬、搔抓和嘶叫等可观察的指标[1]。以下就几种常用的外周神经源性疼痛的实验模型作一概述。

1外周神经源性疼痛动物模型

1.1神经瘤模型(Neuromamodel)

神经瘤模型又称为坐骨神经轴索切断模型,多用于研究临床疾病如截肢后的疼痛。雄性Sabra大鼠(250~300g),麻醉后在无菌条件下,暴露坐骨神经或隐神经,分离周围组织,在股骨中部,用丝线结扎、切断、冷冻或者电切神经干[2],保留的断端可以在9~40d后形成神经瘤。术后动物出现自噬或咬伤侧肢体、足趾,这种异常行为被称为“自残",可能因缺乏感觉神经支配,局部完全失去知觉而被当作异物咬掉。自残持续时间和程度依据手术方法和操作部位的不同而不同[3]。进一步研究发现紧接扎和切断较电切和冷冻的方法,自残行为的产生要少。在复制动物模型时要求研究者严格遵照动物伦理法防止出现过度的自残现象[4]。值得注意的是神经瘤模型没有产生异常疼痛和痛觉过敏现象等外周神经源性疼痛的特异性的标志[5]。

1.2坐骨神经慢性压迫性损伤模型(CCI或者Bennett模型)

Bennett于1988年首次复制出CCI(chronicconstrictioninjuryofthesciaticnerve),克服了上述模型的缺陷,是国际上应用较多的疼痛模型。该模型操作简单,易掌握。方法是采用150~200g雄性SpragueDawley大鼠,氟烷麻醉,暴露坐骨神经干,用40铬制肠线在大鼠股骨中部水平松弛结扎坐骨神经(左侧或者右侧),结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动反应为宜。术后第2天开始出现痛反应,10~14d达高峰,持续2个月后痛反应消失[6]。用该方法复制出的大鼠疼痛模型表现为自发痛(自发抬起损伤肢体,时而舔足、咬足或甩足避免损伤侧的负重)、痛觉过敏(机械痛敏和冷痛敏),轻度或中度的自残现象。多用于肿瘤压迫,重金属离子中毒,缺氧或代谢异常等诱发的神经病性慢性痛的研究[7]。由于铬肠线结扎之松紧度完全取决于实验操作,不同的松紧度可能导致不同程度的神经纤维功能的丧失,因此来自于受损坐骨神经向脊髓节段的传入冲动可能存在差异。

1.3坐骨神经部分结扎模型(PSL或者Seltzer模型)

1990年,Seltzer报道了PSL(partialsciaticnerveligationmodel)模型,模拟外周神经损伤后的烧灼痛,采取单侧高位股骨紧结扎1/31/2坐骨神经。术后数小时,PSL大鼠出现抬足、舔足等自发性痛,痛觉异常和痛觉过敏,可持续7个月以上。PSL的不同之处在于疼痛相关行为出现比较早,一般在几个小时之后;会导致对侧疼痛的产生。多用于同节段内的损伤神经元及正常神经元之间活动的相互影响的研究。由于这一水平支配外周区域的神经纤维在坐骨神经中是随机分布的,不会造成特定区域的感觉丧失,且损伤纤维之定量也无法确知。因此,难以确定哪段脊髓节段损伤最为严重,其重复性和定量分析较差[8]。

研究者在应用PSL模型和CCI模型时发现,两者都容易引起手术局部的炎症反应,造成神经性疼痛和炎性疼痛的之间的相互影响。2000年,ThiesLindenlaub等改进了实验方法,采用坐骨神经部分横断的方法(partialsciaticnervetransection,PST),无外源性结扎丝线的引入,减少了局部的炎症反应,更单一的模拟了外周神经源性疼痛[9]。

1.4L5/L6脊髓神经结扎模型(SNL)

Kim和Chung等在1992年研制成功SNL(L5/L6spinalnerveligationmodel)模型,又称为节段性脊神经结扎损伤模型。雄性SpragueDawley大鼠(160~180g)吸入麻醉后置于热板,暴露脊柱周围区域,打开3~4cm皮肤切口,找到并分离单侧腰5和/或腰6脊神经,用60号丝线紧结扎,切断结扎远端,术后用生理盐水清洗伤口,逐层缝合,尽量减少周围组织的损伤[10]。结扎后异常疼痛和痛觉过敏很快出现,至少持续4个月。坐骨神经是由腰4~6脊神经汇合而成,腰5和腰6脊神经在坐骨神经前紧扎造成坐骨神经的部分损伤。大鼠下肢的神经支配来源于隐神经和坐骨神经的分枝,至少部分隐神经的传入纤维通过腰3节段进入脊髓,因此腰5和腰6脊神经损伤后下肢的神经支配由腰3和腰4节段神经支配。这种明显分区的节段性损伤模型具有较明确的损伤定量和脊髓节段定位,而且有利于研究受损与未受损的神经纤维在疼痛机制中的作用。SNL的优点在于能产生自发性疼痛的行为(保护,舔嗜和同侧后脚的抬起),但是并不产生自残的现象[11]。但有实验发现脊神经结扎能够引起神经性疼痛,但是不是所有的脊神经结扎都会伴有神经性疼痛的产生[12]。

与CCI和PSL相比,SNL的结扎部位和结扎程度更加一致;保留了完整的脊髓部位,便于脊髓疼痛部位的研究。但是,在以上3个动物模型的制备过程中,SNL对手术操作者的要求最高,技术比较复杂[13]。以上CCI,PSL和SNL3种动物模型都可通过大鼠复制产生[14],是目前国际上最为常用的外周神经源性疼痛的动物模型,得到认可和肯定。

1.5L5脊髓神经结扎(L5spinalnerveligation)

SNL模型出现后不久,分别结扎L4或者L5的脊髓神经的动物模型相继出现。结扎L4脊髓神经后引起自主行为的缺陷,严重影响了疼痛行为的测定,因此无法应用。尽管L5脊髓神经结扎机制不是很清楚,但发现结扎L5后,大鼠能产生持续痛敏和机械刺激异常疼痛[15]。L5脊髓神经结扎手术操作与SNL相差无几,但是比SNL所需要的手术操作简单,因此L5脊髓神经的结扎大鼠模型可能是一个不错的选择,特别基因敲除或者转基因大鼠。近期,研究人员还发现损伤的脊神经会对周围正常的神经有一定的影响,这也可能是产生神经性疼痛的原因之一[16]。

1.6低温损伤模型(SCN)

与以上不同,SCN模型是通过低温损伤坐骨神经,导致自残和痛觉过敏。简单说就是采用-60℃的冷冻探头直接接触坐骨神经干,以30s/5s/30s的时间间隔冷冻/解冻/冷冻而造成坐骨神经损伤[17]。综合以上发现,不同的操作(结扎、横断和低温)产生的这些模型之间存在一定的差别,体现在术后的7d不同疼痛的行为。由于SCN模型损伤的神经干周围结缔组织的保存使神经再生可以进行,因此该模型适用于研究暂时性外周神经损伤引起的神经源性疼痛及损伤后修复过程[18]。但是与SNL、PSL和CCI相比,SCN产生的自残、自发性伤害性行为和触觉异常的现象只能持续15~21d[19]

1.7坐骨神经炎神经疼痛模型(SIN)

据统计,将近50%神经性疼痛是由炎症、感染和神经损伤后的炎症反应引起,因此人们开始使用神经炎性模型来研究神经性疼痛[20],如SIN模型。在坐骨神经周围注入酵母聚糖,几小时后产生异常性疼痛,如果剂量足够大,则诱导对侧肢体疼痛的产生。缺点是SIN模型不存在热痛敏[21]。经周围注入死亡的细菌或者角叉菜胶[22]样能诱导产生痛觉过敏和异常疼痛。

2疾病诱导的外周神经性疼痛模型

带状疱疹和糖尿病为两种常见的伴有神经性疼痛的疾病。据研究在西方国家,66%的糖尿病患者有神经性疼痛[23]。带状疱疹性神经性疼痛,往往是急性感染疱疹病毒后,导致病人持续性或者终身疼痛。糖尿病神经源性疼痛模型(diabeticneuropathicpainmodel,DNP)[24]和带状疱疹神经性疼痛模型(postherapeuticneuralgiamodel,PHN)[25]是两种常见的由疾病引起的外周神经源性疼痛模型,还有其他类型神经病理性疼痛,如化疗药物引起的毒性神经病变,静脉注射长春新碱模拟疼痛模型。

3细胞模型

3.1原代感觉神经元的培养

原代感觉神经元可以来自不同物种,一般来源于新生鼠或者胎鼠,分离进行体外培养。感觉神经元还可取自伤害性动物或者药物处理的动物[26]。实验发现,体外培养的三叉神经节和背根神经节的感觉神经元,对辣椒素,缓激肽、P质和PGE都能产生反应,显示出与体内神经元相似的特点[27]。已有的利用细胞模型进行疼痛神经递质的释放、相关信号转导及细胞表面疼痛的介质的研究,证明具有可行性[28]。但是细胞模型之所以没有广泛应用在于还不明确细胞体外培养是否会引起感觉神经元某些基因和蛋白发生改变,对实验造成影响。

3.2永久性感觉神经元的培养

原代感觉神经元的培养保留了体内神经元的特点,更接近实际情况;但是原代培养操作烦琐,细胞数量有限和细胞来源的复杂多样,给实验造成了一定影响。目前建立了的永久性感觉神经元细胞系同样具有体内感觉神经元的特点,或是通过病毒或者特殊原癌基因转染[29];或者与其他无限繁殖细胞相融合建立[30]。

4结语

感觉神经元细胞模型虽然已有20年历史,但在疼痛的研究中并没有广泛应用,原因在于,在培养分化的过程中,感觉神经元的受体、离子通道和神经物质可能发生改变,与体内细胞不同。随着基因芯片和蛋白质组学的发展,可以系统全面的比较在不同的生长和分化环境下基因和蛋白的表达的改变,有利于细胞模型的推广应用。但是就目前来看,细胞模型在研究信号转导和神经递质释放方面有较好的实用价值。不管是动物模型还是细胞模型,都将促进针对慢性疼痛的有效治疗方案治和药物的研发。

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