放射免疫显像研究管理论文
时间:2022-06-02 10:05:00
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摘要目的:将抗人原发性肝癌(PLC)单抗TIGTC-Ⅲ,用胃蛋白酶法消化成F(ab′)2片段,标记131I后进行裸鼠人肝癌移植瘤的体内定位研究。方法:采用胃蛋白酶消化法,进行裸鼠体内核素显像。结果:消化产率为31.7%±2.4%,经细胞结合实验证明F(ab′)2具有良好的免疫活性,抗体片段进入裸鼠体内后,与完整抗体比,进入肿瘤的速度快,生物学分布特异性高,定位指数上升,血清本底下降迅速,生物半衰期明显缩短。结论:F(ab′)2与全抗体比较可使成像时间提前,定位清晰。
关键词单克隆抗体F(ab′)2片段放射免疫显像
ThepreparationofF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibodyTIGTC-Ⅲanditsapplicationintumorradioimmunoimagine
SHILe-Hua,YANGJia-He,CUIZhen-Fuetal.
EasternHepatobiarySurgeryHospital,TheSecondMilitaryMedicalCollege,Shanghai200433
AbstractObjective:InordertorealizetheimmunoimmagingwithF(ab′)2fragmentofmonoclonalantibody(TIGIC-Ⅲ)forPLC.Methods:Monoclonalantibody(TIGTC-Ⅲ)againsthumanprimarylivercancer(PLC)wasdigestedintoF(ab′)2fragmentbypepsindigestion.Afterlabelledwith131Iand125IradioiodinatedF(ab′)2wasinjectedintonudemicebearingtumorxenograftsofPLCviatailveinandradioimmunoimaginewasperformed.Results:TheexperimentresultsshowedthattheyieldofpureF(ab′)2was31.7%±2.4%,theimmunoreactivityofF(ab′)2basedonthecellbindingstudieswasretainedwell.Aftertheinjectionof131I-F(ab′)2intoPLCtumor-bearingnudemice,photoscintigraphywasperformedatintervalsof12h.Thexenograftswerevisualizeddistinctlyduring24~96h.Conclusion:Theratiooftumortonon-tumor(T/NT)washigherthanthoseoftheintactIgGinalltissues.XenograftsofPLCinnudemiceacumulatedTIGTC-Ⅲ.Theexcretionofradioactivitywasdecreasedrepidly.
KeywordsMonoclonalantibodyF(ab′)2Radioimmunoimagine
用胃蛋白酶法制成TIGTC-Ⅲ的活性片段F(ab′)2,标记上131I后进行了裸鼠人肝癌移植模型的放射免疫显像(RII)研究。
1材料与方法
1.1单抗TIGTC-Ⅲ的制备TIGTC-Ⅲ系将肝癌细胞株HEPG2免疫Balb/c小鼠后将其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合而成的杂交瘤分泌的一系列抗体之一,已经抗体的专一性分析[1]。
1.2抗体片段F(ab′)2的制备与纯化按Harlow方法进行[2]。
1.3TIGTC-Ⅲ和F(ab′)2的标记及其免疫活性测定用氯胺T法[3]。标记物用SephadexG-25柱分离,去除游离碘。0.22μm微孔滤膜除菌,用细胞结合分析法测定免疫活性。
1.4荷人肝癌裸鼠模型的建立[4]将PLC细胞接种在4周龄的Balb/c裸小鼠腋部皮下,待肿块长到0.8cm3左右时进行定位及治疗研究。
1.5放射免疫显像及抗体的生物学分布
1.5.1动物处理标记抗体注射前72h起,在饮用水中加1%碘化钾,以封闭裸鼠甲状腺对碘的摄取。
1.5.2TIGTC-Ⅲ及F(ab′)2在荷瘤裸鼠体内的分布[5]12只荷瘤裸鼠,每鼠注射7.4×106Bq的125I-F(ab′)2,给药后每24h处死3只,取肿瘤、血液及各脏器。分别称重并测其放射性算出T/NT。另取3只荷瘤鼠,从尾静脉注入125I-F(ab′)2及非特异性的131I-F(ab′)2,48h后处死,取器官组织称重后分别测放射性计数,计算定位指数。
1.5.3放射免疫显像每鼠注射200μCi/0.1mg的131I-F(ab′)2,对照组注射相同剂量的非特异131I-
F(ab′)2,每12h行γ照射。
1.5.4标记抗体的生物半衰期42只8周龄的Balb/c小鼠,分完整抗体组与F(ab′)2组。分别于给药后12、24、48、72、96、120h处死,分离血清并加200μl肝细胞(1×106),测放射性计数后算出抗体的生物半衰期。
1.5.5TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的体内药代动力学取6只8周龄Balb/c小鼠分全抗体与F(ab′)2组,给药后分别于6、12、24、48、72、96、120h自尾静脉取血10μl,测放射性后绘制放射性-时间曲线。
2结果
2.1抗体片段的制备纯化TIGTC-Ⅲ,经电泳检测纯度大于95%。用胃蛋白酶消化,16h以上消化完全。消化液经层析后第1峰为F(ab′)2。其产率为31.7%±2.4%。
2.2标记抗体的质量控制TIGTC-Ⅲ的标记率为72%,比活度为7.54MBq/mg,放化纯度92.5%±1.7%。TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2标记上碘后,与PLC细胞的结合率分别为45%与28%,mIgG与其F(ab′)2的结合率均小于5%。
2.3不同时间每克肿瘤及其它组织对TIGTC-Ⅲ及其F(ab′)2的摄取量见表1。
2.4不同时间的T/NT值见表2。
2.5定位指数静注碘标抗体后48h,测得定位指数TIGTC-Ⅲ为3.45,TIGTC-ⅢF(ab′)2为5.88。
2.6荷瘤鼠放射免疫显像注入抗体后24h瘤区有放射性浓聚,36h后肿瘤显像。显像最佳时间为全抗体96h左右(图1,B),F(ab′)236~48h(图1,A),mIgG整个显像过程无明显浓聚(图1,C)。
2.7抗体的清除速率及生物半衰期F(ab′)2在心血管的清除明显快于完整抗体,F(ab′)2的生物半衰期约20.0h,全抗体为52.6h左右,两者差异显著。
表1裸鼠组织对完整抗体及其片段的摄取率
Tab.1PercentageintakeofTIGTC-ⅢandF(ab′)2pergramoftissue
Tissue24h48h72h
TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2
Tumor0.311.412.210.793.110.68
Heart0.460.360.480.300.450.15
Blood2.511.451.870.621.620.41
Kidney0.911.750.926.870.760.59
Liver1.620.501.860.321.270.20
Lung0.860.940.670.580.630.22
Muscle0.360.250.310.240.420.15
Spleen1.390.811.520.401.230.19
Bone0.330.210.350.190.470.11
表2裸鼠注射完整抗体及其片段后的T/NT值
Tab.2T/NTvaluesofdifferenttissueinnudemiceafterinvivoinjectionofTIGTC-Ⅲ&F(ab′)2
Tissue24h48h72h
TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2TIGTC-ⅢF(ab′)2
Cerebrum19.5018.3321.8020.2023.5022.80
Bone2.702.852.953.023.202.85
Blood0.690.890.711.180.781.22
Heart1.380.692.502.883.102.72
Intestine2.251.124.754.865.305.58
Kidney1.080.432.150.562.400.81
Liver2.072.552.603.843.024.24
Lung1.270.981.340.761.500.80
Muscle3.503.253.783.453.853.47
Skin0.430.660.981.721.421.56
Spleen1.671.902.253.442.483.89
Stomach1.410.722.853.983.704.65
图1F(ab′)2注入荷人肝癌裸鼠体内后72h的RII
Fig.1TheradioimmunoimageofPLC-bearingnudemice72hafterinjectionofF(ab′)2
3讨论
在以单抗为载体的放射免疫显像中,由于完整抗体的Fc段常与组织细胞的Fc受体结合而使本底清除减慢,从而影响成像,抗体片段优于完整抗体已被许多学者所证实[6]。我们实验结果亦表明F(ab′)2比完整抗体有如下优点:F(ab′)2进入肿瘤速度快,生物学分布特异性提高,定位指数上升,血清本底下降迅速,生物半衰期明显缩短,从而使成像时间提前,成像清晰。
随着影像技术的发展,使原发性肝癌的诊断及定位变得较为容易,因此,单抗在肝癌的应用主要在于放射免疫治疗,由于F(ab′)2的以上特点,使抗体片段在肿瘤部位的摄取量低于完整抗体,且生物半衰期短,免疫活性低,从而用于肝癌导向治疗不如完整抗体。如何解决这一矛盾将是以后进一步研究的目标。
在抗体片段的制备中有两个基本要求,即尽可能高的消化产率及保留免疫活性。本实验采用胃蛋白酶消化法,此法虽然产率较低,但方法简便,免疫活性较高。F(ab′)2片段的免疫活性在标记的前后均低于全抗体,可能是消化过程中酶对其损伤所致,为保留抗体的免疫活性,应尽量缩短反应时间。
作者简介:施乐华,男,40岁,肝胆外科学博士;
指导教师,吴孟超,男,中科院院士,博士生导师,主要研究肝癌的基础研究与临床治疗
作者单位:施乐华杨家和崔贞福吴孟超(第二军医大学东方肝胆外科医院,上海200433)
潘文舟孔令山(第二军医大学长海医院,上海200433)
王明库(黑龙江红兴隆管局中心医院,黑龙江155811)
4参考文献
1施乐华,吴孟超,陈汉etal.分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤TIGTC的制备及专一性分析.第二军医大学学报,1996;17(4):313
2HarlowED.Antibodiesalaboratorymanual.NewYork:ColdSpringHarborLaboratory,1988:615
3肖祥熊.实用放射免疫分析及其临床意义.上海:上海同济大学出版社,1985:5
4刘康达,鱼达,包炎明etal.裸鼠人肝癌模型在肝癌导向研究中的应用.中华肿瘤杂志,1988;10(6):414
5RiethmulleyG,Schneider-GadickeB,SchlimokGetal.RandomisedtrialofmonoclonalantibodyforadjuvanttherapyofresectedDukesCcolorectalcarcinoma.Lancet,1994;343:1177
6GoldenbergDM.Currentstatnsofcancerimagingwithradiolabeledantibodies.JCancerRes,1987;113:203
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