白细胞抗原鉴定管理论文

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摘要目的：用单克隆抗体鉴定白细胞共同抗原并对其性质进行初步分析。方法：用B细胞株3D5免疫Balb/c小鼠得到单抗5H12，借助间接免疫荧光及流式细胞仪分析，检测5H12抗原在多种白细胞表面的表达情况，并从白细胞膜中提取5H12抗原，通过增殖试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹对其特性进行初步分析。结果：5H12抗原表达于多种白细胞表面，包括休止T细胞、休止B细胞、单核细胞、中性粒细胞、体外PHA激活的T细胞、体外anti-μ激活的B细胞、也表达在T细胞株(Jurkat、Peer)、B细胞株(3D5、Daudi、CESS、BJAB)、单核细胞株U937和髓细胞株K652表面。增殖试验表明，该抗原与相应单抗结合后导致B细胞活化抑制。对抗原的初步分析显示：5H12是一种单链蛋白质分子，分子量为22kD。结论：5H12是一种单链膜蛋白分子，属于白细胞共同抗原，与B细胞活化有关。

关键词白细胞共同抗原5H12分子量

Identificationofleukocytecommonantigen(LCA)5H12anddiscoveryofitseffectonBcellactivation

WANGYun-Ping,ZHANGShu-Zhen,ZHULi-Ping.

DepartmentofImmunology,BinzhouMedicalCollege,Binzhou256603

AbstractObjective:Toidentifyleukocytecommonantigen(LCA)withmonoclonalantibody(McAb)andanalyzetheLCA.Methods:ImmunizedBalb/cmicewithBcellline3D5andobtainedMcAb5H12，thendetectedtheexpressionof5H12antigenonvariouskindsofleukocytesandwhitecelllinesbyindirectimmunofluorescenceandflowcytometricanalysisandfinallyisolatedandpurified5H12antigenfromcellmembraneandanalyzedthe5H12byproliferationtest,SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)andWestern-blotting.Results:5H12wasexpressedonapanelofhumanleukocytesandwhitecelllinesincludingrestingTcells,restingBcells,monocytes,neutrophils,PHA-activatedTcells,anti-μ-activatedBcells,Tcelllines(Jurkat,Peer),Bcelllines(3D5,Daudi,CESS,BJAB),binationof5H12antigenwith5H12McAbcouldinduceinhibitionofBcellactivationinadose-dependentmannerandthissuggestedthat5H12mightplayaroleintheprocessthatledtoBcellactivationandproliferation.SDS-PAGEandWestern-blottinganalysisindicatedthat5H12isa22kDone-peptide-chainprotein.Conclusion:5H12isaone-peptide-chainmembraneproteinmolecule,itisaLCAandrelatedtocellactivation.

KeywordsLeukocytecommonantigen5H12Molecularweight

白细胞共同抗原(leukocytecommonantigen,LCA)表达于多种白细胞表面，是一大类粘附分子，具有多种功能，与细胞活动密切相关。在免疫应答过程中，LCA参与免疫细胞间的粘附，充当协同刺激分子，与免疫细胞的识别活化、增殖分化、发挥效应有密切关系。LCA表达缺陷，可导致免疫反应异常。由于其作用重要，LCA已受到广泛重视。本实验鉴定了一种LCA5H12，并对其功能进行了初步分析，为深入研究打下基础。

1材料与方法

1.1仪器、材料与试剂541型流式细胞仪(美国Coulter)；CO2培养箱(美国Shel-Lab)；FITC标记的羊抗鼠IgG，碱酶标记的羊抗鼠IgG，DEAE-SephadexA50，anti-μ，PHA，SDS，过硫酸铵，HAT，TEMED(均为美国Sigma)；RPMI1640(美国GIBCO)；CNBr活化的Sepharose4B(瑞典Pharmacia)；3H-TdR(中国原子能研究所)；NP-40，PEG(瑞士Fluka)；硝酸纤维素膜(美国Bio-Rad)；其它均为国产试剂。各种细胞株由医科院基础所单抗室提供。

1.2单抗制备用人活化的B细胞株3D5免疫Balb/c小鼠。在50%PEG(MW：1450)条件下，将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。融合后的细胞在HAT培养液中培养，杂交瘤细胞经两步进行筛选。先用ELISA法筛选产生高滴度小鼠Ig的阳性孔。再用3D5细胞和人T细胞株Jurkat作靶细胞，经间接免疫荧光染色，用流式细胞仪进行分析，然后对与3D5和Jurkat两种细胞均呈阳性反应孔的细胞作连续3次克隆，最后得到杂交瘤细胞株5H12。接种5H12杂交瘤细胞于Balb/c小鼠腹腔以制备腹水。单克隆抗体5H12的血清型用双向琼脂扩散试验检测。

1.3人外周血单个核细胞(PBMNC)的制备方法见文献［1］。

1.4人外周血T细胞、B细胞、单核细胞、中性粒细胞和红细胞的分离方法见文献［1］。

1.5活化T、B细胞的制备用24孔板培养细胞，每孔加T细胞悬液2ml(含2×106个细胞)，T细胞悬液中加PHA至终浓度2μg/ml，B细胞悬液中加anti-μ至终浓度100μg/ml，5%CO2培养箱孵育72h。

1.6间接免疫荧光试验一抗用5H12单抗腹水。二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，用流式细胞仪检测［2］。

1.7流式细胞仪分析仪器的工作条件为488nm，每个样品均检测10000个细胞，检测参数为FALS，L90°LS和LIGFL，用仪器中的计算机分析阳性细胞百分率及荧光强度。

1.8T、B细胞增殖试验96孔尖底培养板，每孔置1×105个PBMNC，分加PHA(终浓度2μg/ml)，anti-μ(终浓度100μg/ml)和/或5H12单抗腹水(稀释度为1∶1000.0、1∶500.0、1∶250.0、1∶125.0、1∶62.5)，对照用SP2/0腹水，培养板置37℃、5%CO2培养箱孵育72h，孵育前16h加3H-TdR，用细胞收集器收集细胞，液闪计数cpm值，每一条件均设3个平行孔。

1.95H12单抗的纯化先用硫酸铵分级沉淀法，后用DEAE-SephadexA50离子交换法得到纯化的5H12单抗。

1.10膜蛋白的提取、纯化和鉴定按文献［3］提取3D5细胞膜蛋白，按文献［4］用亲和层析法从膜蛋白中纯化5H12抗原，亲和层析柱用的载体为CNBr活化的Sepharose4B，配基为5H12单抗，纯化抗原先经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再进行Western印迹分析，印迹分析时，一抗用1∶200稀释的5H12单抗腹水，对照为CD8单抗腹水，二抗为1∶3000稀释的碱酶标记的羊抗鼠IgG［5］。

2结果

2.1杂交瘤的筛选与克隆用3D5和Jurkat作靶细胞，用间接免疫荧光染色法对产生较多小鼠IgG的杂交瘤进行筛选。取两种细胞同时染色(5H12)的细胞，用有限稀释法经连续3次克隆，得5H12杂交瘤。把5H12杂交瘤注射入Balb/c小鼠腹腔制备5H12单抗腹水。琼脂扩散试验表明5H12单抗为IgG2b。

2.25H12抗原的表达间接免疫荧光染色后经流式细胞仪分析可见休止T细胞、休止B细胞、单核细胞均明显表达5H12抗原，而中性粒细胞弱表达，红细胞不表达，B细胞经anti-μ激活后及T细胞经PHA激活后，细胞表面仍表达5H12抗原。各种细胞株包括T细胞株(Jurkat,Peer)、B细胞株(3D5、Daudi、CESS、BJAB)、单核细胞株U937和髓样细胞株K562均表达5H12抗原。上述结果说明5H12抗原表达于多种白细胞表面，属白细胞共同抗原。

2.35H12抗原对人B细胞增殖的影响功能试验表明5H12单抗能够抑制anti-μ诱导的B细胞增殖。

表15H12单抗抑制anti-μ诱导的PBMNCs的3H-TdR掺入

Tab.1Inhibitionof3H-TdRuptakeofanti-μ-inducedPBMNCsbymonoclonalantibody5H12

3H-TdRuptake(cpm)

—1∶1000.01∶500.01∶250.01∶125.01∶62.5

—1)—5H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/05H12SP2/0

EXP1.1501324118753631131729921114243689425037432041

±243±616±92±183±67±352±165±203±112±442±83±428

EXP2.116528232155267118852858184929721358278913102453

±167±403±391±264±442±50±379±361±110±67±327±537

EXP3.164934112570332223513508221043431748450714562928

±400±386±90±274±86±238±594±404±245±223±251±92

EXP4.1266249750344174103647546353965830927482968

±461±1333±318±2029±74±111±91±1106±135±1182±338±702

Note：1×105PBMNCsin0.2mlof10%FCSRPMI1640wereincubatedatthepresenceof100μg/mlofanti-μfor72h，variousconcentrationsofMcAb5H12orSP2/0wereappliedtothecellcultureatthe0h;1)Withoutanti-μ，EXP：experiment

anti-μ为B细胞丝裂原，对T细胞无作用，因此用anti-μ刺激PBMNC就是刺激B细胞增殖。4次实验表明，anti-μ诱导的B细胞增殖均受到5H12单抗的抑制，此抑制作用随5H12单抗浓度的升高而增强，但抑制作用因个体而异。对照SP2/0腹水则无此作用(表1)。5H12单抗对PHA诱导的T细胞增殖无影响，也不能诱导人PBMNC增殖。

2.45H12抗原的鉴定纯化的5H12抗原在还原和非还原条件下经SDS-PAGE，均只显示一条带，据标准曲线测得其分子量为22kD。Western印迹分析证明这条22kD的蛋白带就是5H12抗原。

3讨论

LCA表达于多种白细胞表面，对细胞发挥生理功能具有重要作用，目前已发现LCA60余种，作用极为广泛，有些LCA的作用已经清楚，而有些尚需探讨。本实验中，我们用制备的单抗鉴定了一种LCA5H12，具有调节B细胞活化的作用。5H12的分子量与已知的LCACD81分子量相同，均为22kD。CD81主要表达在B细胞表面，也表达在单核细胞及T细胞表面，属白细胞分化抗原4次跨膜分子家族(TM-4)成员，具有离子通道作用，但CD81为增殖性抗体的靶抗原，而实验中的5H12为抑制性抗体的靶抗原(对B细胞而言)。因此两者分子量虽然相同，但作用不同。但5H12与CD81的区别尚有待于对多肽链的进一步分析，包括氨基酸的组成、排列、二硫键的数目与位置以及羧基端与氨基端的氨基酸种类。至于T、B细胞5H12抗原与相应单抗结合后表现出不同效应、可能涉及多种因素，如T、B细胞活化的途径不同，表面抗原分布不同，受体与配体亲和力不同，活化途径不同，细胞基因功能活动情况不同等。但只有对5H12抗原进行深入的分子生物学研究，才能完整揭示其生理和病理功能。

张淑珍朱立平中国医学科学院基础医学研究所，北京100730

作者简介：王运平，男，34岁，硕士，讲师，主要从事BRM的研究；

朱立平，男，59岁，教授，博士生导师，主要从事分子免疫学研究

作者单位：（山东滨州医学院免疫学教研室，滨州256603)

4参考文献

1杨景山.血细胞的分离.见：杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物学技术.北京：北医协和联合出版社，1990：4-18

2王德斌，张叔人，刘卓如．细胞免疫学方法选编.北京：人民卫生出版社，1986：289-308

3HarlowE,LaneD.Antibodies：Alaboratorymanual.NewYork:Coldspringharborlaboratory,1988:446-450

4王传怀.亲和层析.见：张承圭，王传怀，袁玉荪etaleds.生物化学仪器分析及技术.北京：高等教育出版社，1990：215-244

5HarlowE,LaneD.Antibodies：Alaboratorymanual.NewYork:Coldspringharborlaboratory,1988:473-506