雷公藤红素诱导研究管理论文

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摘要目的：探讨雷公藤红素对HMC-1细胞表达Fas、Fas-L的影响及与凋亡的关系。方法：用流式细胞仪检测细胞凋亡和Fas、Fas-L的表达。结果：HMC-1细胞能自发表达Fas，不表达Fas-L。经雷公藤红素作用，Fas呈先升后降的变化，Fas-L低水平表达。Fas阳性率下降与凋亡率增加相关。结论：Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一。

关键词雷公藤红素HMC-1细胞FasFas-L凋亡

FasmaybeoneofthemoleculeswhichmediatesHMC-1cellapoptosisinducedbytripterine

BAOYi-Xiao,ZHANGLing-Zhen,LILietal.

ClinicalImmunologyCenterofPLA,ChangzhengHospital,theSecondMilitaryMedicalUniversity,

Shanghai200003

AbstractObjective:ThispaperreportstheeffectoftripterineontheexpressionFasandFas-LinHMC-1cellsandtherelationtoapoptosis.Methods:TheexpressionofFas/Fas-Landapoptosiswereassayedbyflowcytometry.Results:HMC-1cellsconstituantlyexpressFas(22.7%),butnotFas-L.Onexposuretotripterineattheconcentrationof1.0μmol/L,Faspositiverateincreasedto57.5%at2h,thendecreasedto12.5%at4hand2.3%at6h.Fas-Lexpressedatlowerlevel.ThereweresignificantrelationbetweenthedecreaseofFaspositiverateandincreaseapoptosis.Conclusion:FasisoneofthemoleculeswhichmediatesHMC-1cellapoptosisinducedbytripterine.

KeywordsTripterineHMC-1cellFasFas-LApoptosis

雷公藤红素是雷公藤单体之一，属三萜类色素［1］。它能诱导人肥大细胞系HMC-1细胞凋亡［2］，但诱导凋亡的机制尚不清楚［3］。Fas抗原（CD95）是一种膜受体，属TNFR/NGFR家族成员，表达于多种类型的细胞表面，其配体（Fasligand,Fas-L)主要表达于活化的淋巴细胞。Fas与FasL结合能迅速地启动细胞凋亡。本文研究雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡过程中Fas及Fas-L表达的变化及与凋亡的关系，以探讨雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的机制。

1材料与方法

1.1细胞培养HMC-1细胞培养于5％CO2,37℃孵箱中。培养基IMDM(GIBCOBRL)含10%热灭活小牛血清，0.1U/L青霉素，0.1U/L链霉素。培养细胞密度为0.5×106～1.0×106ml-1,取对数生长期细胞待用。

1.2细胞凋亡的检测

1.2.1形态观察HMC-1细胞呈圆或椭圆形。凋亡时细胞膜内陷，核浓缩，形成凋亡小体。

1.2.2流式细胞仪(FCM)DNA含量分析1×106个细胞加50μl含0.1%Triton-X100的碘化丙啶(PI)(5μg/ml)染色，避光放置5min,加0.5mlPBS,上流式细胞仪检测,Multicycles软件分析结果。

1.2.3DNA琼脂糖电泳1×106细胞加100μlTBE缓冲液，0.25%NP-40,0.1mg/mlRnase，50℃水浴30min；再加1mg/ml蛋白酶K,50℃水浴30min，即获得需要的DNA溶液。取30μlDNA溶液于1.8%琼脂糖凝胶电泳,细胞凋亡时可出现梯形条带。

1.3Fas和Fas-L的测定0.5×106个HMC-1细胞，加鼠抗人anti-Fas或anti-Fas-L单克隆抗体20μl，加同型非特异性IgG为阴性对照(ImmunoTech公司),4℃共育30min；加FITC-anti-鼠IgM20μl,4℃共育30min。FCM检测（COULTE，EPICSXL），计数10000个细胞。

1.4凋亡细胞群中Fas的测定中晚期凋亡细胞膜透性可以增加，不加Triton-X100的PI可渗入细胞着色。对细胞进行Fas标记后，加0.1%PI染色，在流式细胞仪上进行双标记分析。

1.5数据处理t检验。

2结果

2.1雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡在雷公藤红素作用下HMC-1细胞可出现细胞皱缩，核浓缩，形成凋亡小体的形态改变（图1)。作用24h,DNA琼脂糖电泳可见梯形条带(图2）。

2.2HMC-1细胞Fas和Fas-L的表达HMC-1细胞大小不等，在流式细胞仪上根据前向散射程度可将其分为大、中、小三群，三群细胞分别占37.5％,12.1%,23.7%，三群细胞Fas的阳性率分别为20.0%,37.1%和6.5%；整群细胞表达Fas的阳性率为22.7％，不表达Fas-L。

图1HMC-1细胞在雷公藤红素作用下呈凋亡形态改变(HE染色，×400)

Fig.1Tripterineinducedmorphologicalchangescharacteristicofapoptosis(HEstain,×400)

Note:CondensationofchromatinandapoptoticbodyformationinHMC-1cells

图2雷公藤红素作用24hHMC-1细胞DNA琼脂糖电泳显示梯形条带

Fig.2AgarosegelelectrophoresisofDNAfromHMC-1cellstreatedwithtripterinefor24hours

Note:Marker:657,458,328,289,176bp

2.3雷公藤红素对HMC-1细胞表达Fas和Fas-L的影响在雷公藤红素作用下Fas阳性率呈先升后降的变化，升高的程度和下降的速率与药物的剂量相关（图3）。Fas-L在1.000μmol/L作用下，0,4,6h分别为0,3.3%,1.8%。0.125,0.250,0.500,1.000μmol/L雷公藤红素作用4h,Fas-L阳性率分别为3.4%,4.0%,5.7%和1.8%。

2.4PI染色阳性细胞群中Fas阳性率增高1.000μmol/L雷公藤红素作用4h，PI染色阳性细胞为21.4%±5.0%（n＝5），PI阳性细胞群中Fas阳性率为29.1%±3.9%，PI阴性细胞群中Fas阳性率为5.7%±1.2%，两者相比有显著差异，P＜0.01。

2.5Fas阳性率与凋亡率变化的关系HMC-1细胞与1.000μmol/L雷公藤红素共育，在0，2，4，8h同时测定Fas阳性率和细胞凋亡率，分析两者的相关性。发现Fas阳性率自2h开始呈下降趋势，细胞凋亡率自2h开始呈上升趋势。至6h,Fas阳性率仅为2.3%，趋于0，细胞凋亡率继续上升，见图4。

图3在雷公藤红素作用下流式细胞仪测定HMC-1细胞Fas阳性率的变化

Fig.3FaspositiveratechangesmeasuredonflowcytometryintripterinetreatedHMC-1cellsFig.4Fasandapoptoticpositiveratechangesin1μmol/LtripterinetreatedHMC-1cells

3讨论

雷公藤红素能以时间和剂量依赖方式诱导肥大细胞系HMC-1细胞凋亡，提示雷公藤红素抗炎症［4］、治疗类风湿性关节炎［5］等与肥大细胞相关疾病的作用与此有关。

既往的研究已经表明，Fas广泛地表达于胸腺细胞，活化T、B淋巴细胞，NK细胞，单核细胞等免疫细胞表面，是介导细胞凋亡，维持细胞数量稳定的重要分子［6］。本实验的研究表明HMC-1细胞也能表达Fas，提示Fas在介导肥大细胞凋亡、维持肥大细胞数量稳定方面发挥重要的作用。HMC-1细胞大小不等，可能与其分化阶段不同有关。它们表达Fas的水平也不相同，提示不同分化阶段的细胞对凋亡的敏感性不同。

多种因素可影响Fas的表达，其表达水平的变化会影响到细胞对凋亡的敏感性。如外周血T细胞在超抗原作用下高水平地表达Fas和Fas-L，由此促进T细胞的凋亡［7］。本实验发现雷公藤红素使HMC-1细胞表达Fas增高，同时诱使Fas-L呈低水平表达。雷公藤红素的这一作用可能与其诱导HMC-1细胞凋亡有关。因为Fas的高表达提高了HMC-1细胞凋亡的敏感性，尤其在体内接触到Fas-L阳性淋巴细胞即可以引起凋亡；在体外接触到Fas-L阳性的HMC-1细胞也可引起凋亡。凋亡细胞群中Fas阳性率增高。凋亡率的增加伴随Fas阳性率的下降，二者在启动时间上一致。这些均支持雷公藤红素促进Fas表达与其诱导HMC-1细胞凋亡有关。

但是，雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡并非均由Fas介导。1.000μmol/L雷公藤红素作用8h，Fas阳性细胞几乎消失，而凋亡率继续升高，48h可达90％，远远高于Fas阳性细胞比例，因此雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡还存在其它途径，Fas只是其途径之一。

Fas可能是雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡的途径之一国家自然科学基金资助项目(编号39400123)

作者简介：鲍一笑，男，34岁，临床免疫学博士，主要研究哮喘的免疫机理

作者单位：(第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003)

4参考文献

1岗艳云，张正行.雷公藤及其单体的药理作用研究进展.中国药科大学学报,1995;26(4):252

2ButterfieldJH,WeilerD,DewaldGetal.Establishmentofanimmaturemastcelllinefromapatientwithmastleukemia.LeukRes,1988;12(4):34

3鲍一笑，孔宪涛，李莉etal.雷公藤红素诱导HMC-1细胞凋亡及与细胞周期的关系.中国中西医结合杂志,1998;18(基础理论研究特集):198

4徐维敏，张罗修，程彰华etal.雷公藤红素对IL-1和IL-2活性及PGE2释放的抑制作用.药学学报,1991;10(9):641

5严云屏，施守义，施宜平etal.雷公藤红素外用治疗类风湿性关节炎局部肿瘤.新药与临床，1989;8(6):365

6KrammerPH,DanielJ,WalaczakHetal.TheroleofAPO-1-mediatedapoptosisinimmunesystem.ImmunolRev，1994;142:175

7RennoT,HahneM,TschoppJetal.PeripheralTcellsundergoingsuperantigen-inducedapoptosisinvivoexpressB220andupregulateFasandFasligand.JExpMed，1996;183(2):431