细胞原位杂交方法研究论文

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摘要目的：建立NPYmRNA的细胞原位杂交检测方法，并以NGF为诱导因子研究Dex对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中NPYmRNA表达的影响。方法：采用细胞原位杂交方法。结果：NGF具有诱导NPY基因表达的生物学效应且呈剂量效应关系；Dex对NPYmRNA表达具有双相调节效应，即早期(<8h)可促进NGF的诱导作用，而晚期(>16h)则具有抑制作用(P<0.01)，但单独Dex对NPYmRNA表达无显著影响。结论：可以用细胞原位杂交方法检测NPYmRNA在细胞中的表达。

关键词神经肽Y细胞原位杂交mRNA

TheexpressionofNeuropeptideYmRNAinPC12celllinesdetectedbyinsituhybridization

ZHANGLiang-Lin,YANGGui-Zhen.

DepartmentofImmunology,NormanBethuneUniversityofMedicalSciences,Changchun130021

AbstractObjective:TheexpressionofNeuropeptideY(NPY)mRNAwasdetectedinPC12.Method:Cellularinsituhybridization.Results:NGFcaninducetheexpressionofNPYmRNAinPC12cellswiththerelationshipsofdosage-effectandtime-effect.Dexamethasone(Dex)potentiatedsignificantly(P<0.01)thestimulationbyNGFatearlytimes(<8h),butstronglysuppressed(P<0.01)itatlatertimes(16h).TheresultsalsoappearedthatNPYmRNAabundancecouldntbeeffectedbyDexalone.Conclusion:ThedetectionofexpressionNPYmRNAcanusemethodofcellularinsituhybridization.

KeywordsNeuropeptideYInsituhybridizationmRNA

NPY具有广泛的生物学活性并参与机体的多种病理生理过程，其在体内表达异常与许多疾病关系密切，但机制未明，因此开展NPY基因表达调控的研究对深入地认识其在疾病发生、发展和转归过程中的作用具有较重要的理论和临床意义。在本室系列工作的基础上［1-4］，本文建立了NPY基因表达的细胞原位杂交检测方法，并初步开展NPY基因的表达调控研究。

1材料与方法

1.1材料PC12细胞(中科院上海细胞所细胞库)。随机引物标记试剂盒(Promega公司)；〔α-35S〕dATP(杜邦公司)；rhNGF(邦定生物医学公司)，蛋白酶K、RNaseA(Sigma公司)，核4乳胶(北京原子能研究所)，地塞米松(Dex)、去离子甲酰胺、APES和多聚甲醛(华美公司)，小牛血清(杭州四季青)，马血清(解放军农牧大学)，IMDM(GIBCO公司)。OlympusPM-10AD显微镜。TA-NPY质粒由本室保存。

1.2探针制备常规方法扩增质粒后回收NPYcDN段，按随机引物标记试剂盒说明制备35S-NPYcDNA探针，纯化后-20℃保存备用。

1.3细胞培养PC12细胞置含5%小牛血清、10%马血清的IMDM中培养后，接种于24孔培养板(1×106/孔)，加不同刺激物作用不同时间后，收集细胞用于标本制备。

1.4细胞内mRNA原位杂交

1.4.1载玻片和盖玻片的预处理载玻片经清洗洁净后于180℃烤4h以上，涂APES(按1∶49比例用丙酮配制)，室温凉干后置-20℃保存备用。盖玻片经硅化液浸泡10min，95%乙醇冲洗，180℃烘烤4h以上备用。

1.4.2细胞标本制备用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗细胞悬液2次，调细胞数至1×105ml-1，混匀后取0.1ml用Cytospin离心涂片，室温自然凉干后于4%多聚甲醛固定10min，转移至0.01mol/LPBS(pH7.4)10min，经系列酒精脱水，-20℃保存备用。

1.4.3原位杂交标本过95%、80%、70%序列乙醇，DEPC处理过后用ddH2O冲洗，然后依次加入0.2mol/LHCl室温20min、2×SSC70℃30min、蛋白酶K混合液(1μg/ml蛋白酶K、200mmol/LTrisHClpH7.4、20mmol/LCaCl2)37℃15min，序列乙醇脱水凉干。将杂交液〔50%甲酰胺、100mmol/LTrisHCl(pH7.5)、1mmol/LEDTA、600mmol/LNaCl、10×Denharts溶液、变性鱼精DNA(10μg/ml)和tRNA(250μg/ml)、标记探针(1×105cpm)〕30μl滴于标本上，盖上硅化的盖玻片或用新的parafilm于湿盒中37℃保温16～18h。杂交结束后用2×SSC洗盖玻片，在50%甲酰胺和2×SSC混合液中于37℃洗3次，每次10min；换50%甲酰胺和1×SSC于37℃洗3次，每次10min；1×SSC室温洗3次，每次10min，经序列乙醇脱水凉干。

1.4.4放射自显影将标本涂核4乳胶，待干后于4℃自显影5～7d，经D19显影F5定影。流水冲洗后做HE染色，显微镜下镜检计数。

1.5结果判定及统计学处理结果判定以计数20个细胞内的银粒数计算平均值，进行t检验。

2结果

2.1细胞原位杂交方法的特异性为确定本方法检测NPYmRNA的特异性，特设立不同对照组包括未加刺激物的空白对照组、RNaseA消化组和无探针对照组(见图1)。结果表明，未加任何刺激物的细胞内银粒数较低(4.87±1.45)，而经NGF(50ng/ml)刺激(24h)后银粒数显著增高(38.61±7.76)(与对照组比P<0.01，n=20)；后者经RNaseA酶(25μg/ml)处理30min后发现银粒数(16.88±5.26)显著低于未经RNaseA消化组(P<0.01，n=20)；而虽然NGF刺激但未加NPYcDNA探针组则只有少数细胞出现了1～3个乳胶非特异显影形成的银粒(1.41±1.09)。

2.2NGF剂量与NPYmRNA表达的相关性PC12细胞经不同剂量NGF刺激24h后，杂交结果显示：随着剂量增高细胞质中的银粒数相应增加，具有明显的剂量效应关系(r=0.9950，P<0.01)，见图2。提示NGF具有诱导PC12细胞NPY基因表达的生物学效应。另外亦观察到随着NGF浓度增加，PC12细胞轴突长出的长度增加。

2.3NGF诱导NPY基因表达的时间效应及Dex对NGF刺激的调节作用PC12细胞达50%融合度时用NGF(60ng/ml)和/或Dex(1μmol/L)处理不同时间，包括长时程(1、2、3、4、5、6d)和短时程(1、2、4、8、16、32h)，原位杂交结果显示短时程时，NGF的刺激作用与NPYmRNA表达具有明显的时间效应关系：Dex单独作用不明显，但对NGF的诱导作用具有双相调节效应，即早期(<8h)具有显著促进作用(P<0.01)，而晚期(>16h)则抑制NGF的刺激作用(P<0.01)，见图3。长时程时，NGF的刺激作用仍具有时间效应关系，在第4天后出现“平台”；Dex与NGF联合作用时可下调NGF的诱导作用，而单独Dex则提高NPYmRNA表达水平，但并无显著差异，见图4。

3讨论

细胞原位杂交方法涉及细胞生物学和分子生物学两方面技术，在保持细胞形态完整情况下与待检细胞内特定的未知核酸序列相结合，直接观察单个细胞内特定基因表达水平，所需样品量少(104细胞即可)，mRNA表达相对较低时更为实用，故该方法用于体外较难培养的细胞(如神经细胞)中基因表达的研究则更实用。本文建立的NPYmRNA表达的细胞原位杂交检测方法，通过建立阳性、阴性对照及RNaseA加NGF作用组，结果显示这一方法的准确性和可靠性。目前检测原位杂交结果(包括细胞和组织原位杂交)国外已较普遍使用图像扫描分析进行定量；国内目前尚未普及，大多仍采用显微镜(油镜)下计数银粒的半定量方式统计原位杂交检测结果。本文在研究过程中采用盲法以三人计数结果的平均值为准，每份标本计数20个细胞内的银粒数，求均值后进行统计学分析，以排除主观因素的干扰。

机体内NPY基因表达异常与多种疾病有关，如近年研究显示NPY参与肥胖基因表达调控，提示对NPY基因表达调控研究具有重要的理论和临床意义。本文建立NPYmRNA原位杂交检测方法为进一步基因表达调控研究打下了基础。

用细胞原位杂交方法检测NPYmRNA在PC12细胞中的表达本课题受国家自然科学基金资助(39370622)

张亮林通信地址：中科院上海生化所55号信箱，上海200031

作者简介：张亮林，男，33岁，医学博士，现为中科院上海生化所博士后

作者单位：(白求恩医科大学免疫教研室，长春130021)

4参考文献

1麻彤晖，于永利，杨贵贞.大鼠NPY前体融合蛋白在大肠杆菌中的超表达.中国免疫学杂志，1994；10(5)：298

2张亮林，杨贵贞.大鼠神经肽YcDNA克隆、测序及哺乳动物细胞表达载体的构建.中国免疫学杂志，1996；12(2)：1

3张亮林，杨贵贞.截肢应激大鼠HPAA-脾靶器官中NPY阳性细胞数的变化.中国神经免疫学和神经病学杂志，1996；1(1)：23

4张亮林，杨贵贞.大鼠神经肽Y基因在COS-7细胞中的表达.中国免疫学杂志，1996；12(6)：331