大肠杆菌抗体制备研究论文

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摘要目的：为了制备nNOS特异性抗体。方法：用PCR的方法克隆出nNOS708～881aa片段的编码基因并将之插入pET28a原核表达载体。结果：成功地在大肠杆菌中获得高效表达。经HisTag-Sepharose和电泳回收法得到纯蛋白，将此蛋白免疫兔，制备出nNOS特异性抗体，抗体效价可达1∶8000。利用该抗体成功地检测了正常肌肉和DMD肌肉中nNOS的含量变化，证实DMD肌肉中nNOS的含量明显低于正常肌肉。结论：制备的抗体具有较高的特异性，对nNOS的免疫检测具有重要应用价值。

关键词nNOS特异性抗体重组表达肌肉

RecombinantexpressionofnNOSfragmentinE.coliandpreparationofspecificantibodyagainstnNOS

CHENQiang,ZHUMin-Sheng,SHENYueetal.

NanjingMilitaryInstituteofMedicalScience,Nanjing210002

AbstractObjective：TopreparethespecificantibodyagainstnNOS.Methods：Clonedagenefragmentcoding708to881aaofnNOSwithPCRandinsertedthefragmentintoapET28aexpressionvector.Results:RecombinantproteinwasexpressedeffectivelyinE.coliandpurifiedwithHisTag-Sepharoseandelectrophoresis.Usingthepureproteinasantigen,immunizedrabbitsandobtainedhighspecificandhightiter(1∶8000)antibodyagainstnNOS.WesternblotassayshowedthatnNOSexpressedinnormalskeletalmuscleismuchhigherthanthatinDMDskeletalmuscle.Conclusion:Theanti-nNOSantibodywithagoodspecificitywaspreparedandtheantibodywasusefulforimmunologicaldetecteionofnNOS

KeywordsnNOSSpecificantibodyRecombinantexpressionSkeletalmuscle

一氧化氮合酶(NOS)有3种同工酶，即诱生型(iNOS)、内皮细胞型(eNOS)和脑型(nNOS)，它们均以L-精氨酸(L-Arg)为底物，在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等辅助因子的作用下生成L-胍氨酸和一氧化氮(NO)［1，2］。nNOS主要分布于小脑、骨骼肌、外周氮能神经、交感神经、肾上腺、脊髓的某些区域等部位。nNOS的表达异常与某些疾病密切相关，如神经、肌肉疾病等［3，4］。在nNOS的研究中，特异性抗体是非常重要的研究工具，由于nNOS与其他NOS之间存在有较高的同源性，且分子量较大(160kD)，这就给nNOS抗体的制备带来较大困难。目前国外采用多肽合成的方法成功地制备了nNOS特异性抗体。我们通过基因工程的方法表达了nNOS特异性区域，并制备出了高效价的特异性抗体。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒和菌种pCMV/nNOS质粒，内含大鼠nNOS全长cDNA，由美国德克萨斯大学西南医学中心提供，pET/28a(+)表达载体购自Novegen公司，pGEM/3z质粒购于Promega公司。BL21及JM109宿主菌由本实验室保存。

1.1.2酶和蛋白质及常用试剂各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Boehriger公司、Promega公司、华美生物工程公司。Lambda/Hindlll,pBR322/HinflDNA分子量标准购自Gibco-BRL公司，HisTagTM-Sepharose购自Novegen公司，nNOS抗体(p9203多肽合成法制备的抗体)由美国西南医学中心提供，常用化学剂主要为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1PCR扩增及基因重组技术参考文献［5］。

1.2.2重组蛋白的纯化按Novegen公司的产品说明书进行，经HisTagTM-Sepharose纯化的蛋白再用电泳回收法纯化，参考文献［6］。

1.2.3抗体的制备将2～4mg纯化蛋白与完全弗氏佐剂混匀，充分乳化，接种至新西兰大耳兔足蹼，2w后加强免疫1次，1w后追加免疫1次。

1.2.4Westernblot分析参见文献［4］。在检测肌肉样本中的nNOS蛋白时，将新鲜肌肉置于缓冲液A(10mmol/LTrisCl,1mmol/LEDTA/EGTA,0.5mmol/LPMSF)中匀浆，取匀浆液作常规电泳。Duchenne肌营养不良症(DMD)的肌肉标本由南京市儿童医院神经内科提供，正常肌肉由江苏省肿瘤医院提供，mdx小鼠肌肉样品(已处理)由美国西南医学中心提供。

2结果

2.1nNOS(708～881aa)蛋白片段编码基因的克隆及重组表达质粒的构建用特异性引物1∶5′GG-GATCCATATGTCCTTTGAGTACCTAT-3′和引物2∶5′-CGGAATTCTATCAGAACCTCACTAAGG-3′，以pCMV/nNOS质粒为模板，扩增后得到0.6kb的特异性片段，将扩增片段用EcoRI和NdeI双酶切，电泳回收后与相同酶酶切的pET28a表达质粒DNA进行连接反应，经筛选得到重组质粒，命名为pET/nNOS180，其质粒图谱如图1，用不同限制性内切酶进行酶切图谱鉴定，结果证实：插入片段中含有一个BglII位点和两个NcoI位点，与已报道序列完全相符，如图2。

图1pET/nNOS180重组质粒图谱

Fig.1PlasmicmapofpET/nNOS180

图2pET/nNOS180重组质粒的酶切图谱

Fig.2RestrictionmapofpET/nNOS180recombinantplasmid

Note:laneM:lambdaDNA/HindIIImarker;laneA:pET/nNOS180(BglⅡ);laneB:pET/nNOS180(NcoI);laneC:pET/nNOS180(EcoRI/NdeI)；laneD:pET/28a(EcoRI/NdeI)

2.2nNOS蛋白片段的表达和纯化将重组质粒导入BL21宿主菌后，即得到重组工程菌，经IPTG诱导后，可见明显的额外表达带，如图3，重组蛋白约占菌体蛋白的10%～15%，经SDS-PAGE电泳初测分子量为22.000kD，纯蛋白用质量飞行质谱测得分子量为22.364kD，与理论计算值(22.117kD，不考虑蛋白修饰)基本相符。pET28a载体中含有6个连续组氨基酸序列，这样，重组蛋白即可通过金属离子螯合的方法进行快速纯化。我们用Ni离子螯合的方法一次纯化重组蛋白的纯度可达90%以上，如图4。为得到更纯的蛋白作免疫抗原，我们又用电泳回收的方法得到纯度为100%的纯化蛋白(图谱略)［6］。

2.3nNOS特异性抗体的制备及活性鉴定通过3次免疫后获得抗血清，用常规间接ELISA法测得在抗体稀释度分别为：1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000时，OD492nm与空白对照的比值(P/N)分别为9.5、8.5、8.1、5.4、2.6和1.6，抗血清的工作浓度初步可定于1∶8000范围内。

为了观察nNOS抗血清与iNOS和eNOS的交叉反应，我们分别用3种NOS的标准品进行SDS-PAGE电泳、转移和Westernblot分析，结果证实抗血清对iNOS和eNOS无任何交叉反应，如图5。业已证实，正常横纹肌中含有大量的nNOS蛋白，而DMD中含量明显减少［3，4，7］，我们分别用自制抗体(下称抗血清)和多肽法制备的抗体(P9203)对肌肉标本中的nNOS进行了Westernblot分析。结果表明：抗血清的工作浓度为1∶6000时仍可检测到小鼠肌肉中的nNOS蛋白，其阳性条带与P9203的阳性条带相似(图未列出)。用1∶6000的抗血清以相同的Westernblot方法证实正常人肌肉中的nNOS含量明显高于DMD肌肉中的含量，与文献报道完全一致，如图6。

图3nNOS180重组蛋白在大肠杆菌中表达

Fig.3ExpressionofnNOS180inE.coli

Note:laneA:inducedfor0h;laneB:inducedfor1h;laneC:inducedfor2h;laneD:inducedfor3h;laneE:inducedfor4h;laneM:proteinmolecularweightmarker

图4经HisTag-Sepharose纯化nNOS重组蛋白的电泳图谱

Fig.4ElectropheresisfornNOSrecombinantproteinpurifiedbyHisTag-Sepharose

Note:laneAandB:purifiedprotein;laneM:proteinmolecularweightmarker

图5nNOS抗血清与iNOS和eNOS的交叉反应测定

Fig.5Crossreactiondetectionforanti-nNOSantiserumwithiNOSandeNOS

Note:lanen:nNOSstandardprotein;lanei:iNOSstandardprotein;lanee:eNOSstandardprotein

图6nNOS蛋白在DMD肌肉和正常骨骼肌中的表达

Fig.6ExpressionofnNOSproteininDMDandnormalmuscles

Note:laneM:prestainedproteinmolecularweightmarker;lane1:normalmuscles;lane2and3:mdxmousemuscles;lane4and5:DMDmuscles

3讨论

我们通过PCR的方法克隆了nNOS708～881aa片段的编码基因并将之插入pET28a原核表达质粒，成功地在大肠杆菌中进行了高效表达。我们首次以nNOS708～881片段蛋白为抗原，免疫动物后得到高效价和高特异性抗体，采用上述抗体，成功地检测了正常横纹肌和DMD肌肉中nNOS的表达情况。

nNOS的N端与其它类型NOS的N端相比，有一段额外序列，就序列特异性讲，该段蛋白可作为免疫抗原并得到特异性抗体，但nNOS的N端含有GLGF序列能与庞大的GLGF相关蛋白(GAP)呈紧密结合［8，9］，抗原决定簇易被掩盖，影响检测效果。目前国外采用多肽合成的方法，人工合成C端18个氨基酸，以此为抗原制备出特异性抗体。但由于合成肽较小，制备的抗体效价较低(最高为1∶5000)且所含抗原决定簇少，可能会影响检测的灵敏度。本文实验证实，选择nNOS蛋白的中间区域作为免疫抗原即可克服上述缺点，另外，由于nNOS708～881aa位于钙调蛋白(CaM)结合区和FAD结合区之间，是电子传递的重要途径，我们所制备的抗体还可与之结合后并中和nNOS的酶活性(资料未列出)。

朱东亚中国药科大学新药研究中心，南京210005

智刚KimSLauJamesTStullUTSouthwesternMedicalCenteratDallas,TXUSA

作者简介：陈强，男，24岁，硕士生，主要从事生化药理学研究；

指导教师，朱敏生，男，34岁，博士生，副研究员，主要从事分子生物学和分子免疫学研究

作者单位：(南京军区军事医学研究所，南京210002)

4参考文献

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