瘤细胞库建立应用管理论文

导语：瘤细胞库建立应用管理论文一文来源于网友上传，不代表本站观点，若需要原创文章可咨询客服老师，欢迎参考。

摘要目的：为了对流感病毒甲型和乙型、副流感病毒1、2和3型、呼吸道合胞病毒及腺病毒3、7型主要呼吸道病毒进行快诊。方法：从1986到1997年应用杂交瘤单抗技术，制备出以上4类8种抗病毒单抗细胞库，连同用于连接物的抗碱性磷酸酶单抗细胞株，共有117株单抗细胞株。将以上4类8种病毒单抗连接抗碱性磷酸酶单抗复合物，以兔抗鼠搭桥进行APAAP桥联快速诊断。结果：获得满意结果，此技术结果清晰，无内源性酶干扰，只需1台普通光学显微镜，2～3h可获得准确结果。本系列快速诊断试剂已获得国家4项新药证书及5项生产文号。结论：此抗主要呼吸道病毒单抗细胞库，不仅可提供快诊试剂，也可提供病毒亚型分析、病毒变异以及基因表达研究试剂。

关键词主要呼吸道病毒单克隆抗体杂交瘤细胞库

Establishmentandclinicalapplicationofthehybridomacellbankofmonoclonalantibodiesagainst8typesofmainrespiratoryviruses

DUANPei-Ruo,ZHANGLi-Li,HANHong-Yanetal.

DepartmentofClinicalExperiment,No.262HospitalofPLA,Beijing100088

AbstractObjective:The8types,4kindsofmainrespiratoryviruseswhichcausehumanrespiratorydiseases,includeinfluenza-A、B,parainfluenzavirus1、2、3,respiratorysyncytialvirusandadenovirus-3、7.Methods:Haddevelopedakittorapidlydiagnosethesevirusesfrom1986to1997.Bythetechniqueofhybridoma,hadprepared117hybridomacellstrainssecretingMcAbsofthese8types,4kindsofvirusesandofalkalinephosphatase.TheMcAbsformajunctionalcomplexplusalkalinephosphataseanti-alkalinephosphatase(APAAP)bridgedrapiddiagnosis.Results：Theresultofthekitiscredible,andnodisturbanceofPendogenousenzyme.Performingthediagnosis,onlyneedageneralopticalmicroscopeandcanfinishin2or3h.Thehybridomacellbankcanprovidenotonlythereagentsoftherapiddiagnosis,butalsothereagentsforanalysisofvirussubgroups,virusvariationandgeneexpression.Conclusion:Theserialreagentsoftherapiddiagnosishavebeengranted4newdrugcertificatesand5productioncertificatesbytheministryofHealthDepartmentofNationalHealth.

KeywordsMainrespiratoryvirusesMonoclonalantibodyHybridomacellbank

国内外专著指出：对人类，尤其是婴幼儿，威胁最大的为流感病毒甲（Influenza-A,FluA）和乙型（Influenza-B,FluB）、副流感病毒1、2和3型（Parainfluenzavirus1、2、3,PIV1、2、3）、呼吸道合胞病毒（Respiratorysyncytialvirus,RSV）及腺病毒3、7型（Adenovirus-3、7,Adv3、7），急性呼吸道病毒的实验诊断应首先考虑以上这4类8种病毒［1，2］。从1986～1997年应用淋巴细胞杂交瘤生物技术，完成了以上4类8种病毒单克隆抗体（Monoclonalantibody，McAb）杂交瘤细胞系的制备以及快速诊断桥联试剂、抗碱性磷酸酶单克隆抗体杂交瘤细胞系的制备工作，共9大系117株单抗细胞株。此报道如下。

1材料与方法

1.1第一抗体即4类8种抗病毒单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

1.1.1病毒抗原来源均严格采用标准品。流感病毒甲型和乙型毒株购于首都病毒研究所流感中心［3，4］，副流感病毒1、2、3型毒株购于美国马里兰州ATCC国际毒株库［5-7］，呼吸道合胞病毒long株由友谊医院病毒室提供［8］，腺病毒3、7型毒株由预防医学科学院病毒研究所毒株库提供［9］。

1.1.2动物免疫病毒采用Balb/c小鼠易感系统加脾攻击方法进行［3-9］，碱性磷酸酶采用皮内半佐剂加静脉免疫［10］。

1.1.3细胞融合按文献［1］常规法进行。

1.1.4阳性孔检测用IFA荧光法以及间接反向ELISA。

1.1.5细胞株的鉴定所有的细胞株要求经3次以上亚克隆，3次反复冻存，3个月的37℃环境下传代，对52株单抗做Ig亚型分析，染色体分析，每株均要求作阻断、替代、交叉、封闭以及稳定性6种特异性鉴定［3-10］。

1.2第二抗体即兔抗鼠的制备按文献［1］进行。

1.3第三抗体即抗碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase，AP）单克隆抗体细胞系及其复合物（APAAP）的制备动物免疫用的抗原系美国Promege公司产的精酶，采用反向间接ELISA检测技术获得抗碱性磷酸酶单克隆抗体细胞系，然后选择单抗最适浓度结合抗原，制成APAAP复合物［11］。

1.4快速诊断两种技术

1.4.1将8种抗呼吸道病毒单抗用于桥联（APAAP)

快速诊断技术。

1.4.2将8种抗呼吸道病毒单抗用于间接荧光（IFA）快速诊断技术［7-9，12］。

1.5临床应用方法

1.5.1研究者的临床应用见文献［6-9，11，13］。

1.5.2协作者的临床验证见文献［14-16］。

1.5.3国外产品应用WHO标准品验证［6-9］。

2结果

2.18大系单抗细胞库的建立和鉴定结果

2.1.1建立起一个比较完整的抗主要呼吸道病毒单抗杂交瘤细胞库1986～1997年共获8大系108株单抗细胞株：抗甲型流感11株；抗乙型流感6株；抗腺病毒3型14株；抗腺病毒7型7株；抗副流感1型18株；抗副流感2型5株；抗副流感3型22株；抗合胞病毒25株。以上8大系单抗杂交瘤细胞系的建立见文献［3-11］。

2.1.2系列单克隆抗体Ig亚型和效价分析见表1。

2.1.3系列单抗的效价测定用于临床快速诊断的以上52株单抗，平均结合病毒效价为8000～32000(+++，荧光法)，其连接物碱性磷酸酶单抗效价

表18种主要呼吸道病毒单克隆抗体Ig亚型分析

Tab.1AnalysisofIgsubtypesofMcAbsagainst8typesofmainrespiratoryviruses

McAbsNumber1)Igsubtypes

IgG1IgG2aIgG2bIgG3IgM

FluA11623

FluB5113

PIV16411

PIV25212

PIV3624

RSV871

Adv7532

Adv333

AP33

Total5215161218

Note:1)allofthe52cell-linesselectedwereusedfortherapiddiagnosis达2000万（+++，反向间接ELISA），证实9大系列单抗均具有高度的敏感性和亲和力，效价要高出动物抗血清20～600倍，且无抗细胞抗体混杂。

2.1.4单抗的特异性鉴定结果交叉试验：各株单抗分别与常见的9～12种呼吸道病毒抗原和相关病毒（腮腺炎病毒、麻疹病毒等）作交叉试验，结果无交叉反应。阻断试验：各株单抗分别以异种动物抗血清作阻断，血清在1：2～1：8时，系列单抗被特异阻断。替代试验：以1%小鼠血清替代系列单抗作已知阳性标本，均为阴性。免疫印迹反应（Westernblot）、结合表位鉴定：合胞病毒（8株）、副流感1、2、3型（16株）、腺病毒3、7型（8株），抗原经还原处理后，单抗能清晰地与对应病毒蛋白的表位结合［14］。单抗的纯化和冰干：经盐析用DEAE-52离子交换层析后，比活性达95.2U/mg以上。将各株单抗按8个单位应用效价稀释后按8种抗病毒抗体分别混合组成诊断试剂，制成冰干品。

2.2兔抗鼠（二抗）及兔抗鼠荧光标记免疫效价为1：32（+++，双扩法），兔抗鼠以荧光标记纯化，应用效价为1：10稀释。

2.3碱性磷酸酶单抗及复合物结果共获单抗细胞株9株，单抗在16000U/ml时结合碱性磷酸酶抗原4U，成为APAAP复合物。

2.4系列呼吸道病毒单抗用于桥联快速诊断的质量指标结果见表2。表2系国外快速诊断试剂和病毒分离、双份血清、WHO-McAb标准品和IFA技术对照所得。以上结果证实系列单抗用于桥联快速诊断的各项指标符合生物试剂标准。

表2系列呼吸道病毒单抗用于快速诊断的质量指标

Tab.2ThequalityresultsofseriesofMcAbsusedintherapiddiagnosis

IndicatorViruses

FluPIVAdvRSV

Sensitivity(%)93.30100.0090.0093.50

Specificity(%)100.0099.0099.40100.00

Pseudo-positiveratio(%)01.000.580

Pseudo-negativeratio(%)6.70010.006.20

Positivepredictionvalue(%)93.70100.0090.0090.00

Negativepredictionvalue(%)100.0096.0098.40100.00

Grossuniformity(%)92.3099.0098.8096.00

Adjusteduniformity(%)92.3598.0094.5095.70

Youdenindex0.8900.9900.8970.930

2.5系列呼吸道病毒单抗用于桥联快速诊断试剂申请的国家新药证书和文号从1991～1994年经申请和审批，共获4项新药证书和5项生产文号，它们是合胞病毒，(93)卫药证字S-05号，(93)卫药准字(京星)S-02号；副流感1、3型，(94)卫药证字S-21号，(94)卫药准字(京星)S-01号；副流感2型，(94)卫药证字S-25号，(94)卫药准字(京星)S-03号；腺病毒3、7型，(94)卫药证字S-22号，(94)卫药准字(京星)S-02号；流感A和B型，(94)卫药准字(京星)S-01号。

3讨论

急性病毒性呼吸道感染是人类最常见的传染病，尤其是军营、学校、幼儿园等人群聚集的地方，常在流行期呈几十人甚至几百人发病，人们往往很难弄清病毒病因。本研究用10年时间建立起比较完整的抗主要呼吸道病毒单抗杂交瘤细胞库，连同连接物碱性磷酸酶单抗杂交瘤细胞株，此库共有9大系117株细胞株，其中抗副流感1、2、3型和抗呼吸道合胞病毒G蛋白单抗等70株为国内少见报道的细胞株。该库的建立，不仅可不间断地提供8种主要呼吸道病毒快速诊断试剂［14-17］，还可为国内主要呼吸道病毒的亚型分析、病毒变异以及基因表达等提供研究试剂［18，19］。

本研究创立的抗主要呼吸道病毒桥联诊断试剂，克服了内源酶对结果的干扰，只需1台普通显微镜即可观察细胞内病毒抗原存在，其结果清晰快速，2～3h可获得准确诊断结果［11，13，15，16］。我国是世界公认流感病毒大流行株及变异株发源地，此试剂有较大的实用价值，本研究者曾3次在6h内快速报道流感疫情［20，21］。系列诊断试剂经国家生物制品鉴定所严格鉴定和审查，已获4项国家新药证书，5项生产批准文号，它们是国内首次按“药品管理法”审批程序批准的系列呼吸道病毒单抗桥联快速诊断试剂。

作者简介：段佩若，女，62岁，主任技师，主要从事医学呼吸道病毒学研究

作者单位：(解放军第262医院医学实验科，北京100088)

4参考文献

1郭元吉.呼吸道病毒.见：黄桢祥主编.医学病毒学基础和实验技术.北京：科学技术出版社，1990：655

2GlezenW.Seriousmorbidityandmortalityassociatedwithinfluenzaepidemics.EpidemiolRev，1992;4:253段佩若，韩洪彦，张容惠etal.抗甲型流感病毒内部抗原和表面抗原(H3N2)单抗的制备和分析鉴定.中国免疫学杂志，1996;12(Suppl.):131

4韩洪彦，张容惠，张励力.抗乙型流感病毒单克隆抗体的制备和分析.细胞与分子免疫学杂志，1997;13(3):53

5段佩若，张励力，韩洪彦etal.副流感1型单克隆抗体细胞库的建立.单克隆抗体通讯，1993;9(2):60

6段佩若，张励力，韩洪彦etal.单克隆抗体用于免疫荧光技术快速诊断检测副流感病毒3型抗原的研究.中华微生物学和免疫学杂志，1992;12(5):393

7段佩若，张励力，韩洪彦etal.副流感2型单克隆抗体的制备和应用.中华实验和临床病毒学杂志，1994;8(2):171

8段佩若，赵一博,赵华etal.呼吸道合胞病毒单克隆抗体细胞系的建立和临床应用.中华医学杂志，1989;69(3):174

9段佩若，张励力，韩洪彦etal.腺病毒3、7型单克隆抗体快速诊断试剂的制备和应用.单克隆抗体通讯，1993;9(2):68

10段佩若，朱仁英，张励力etal.应用离子交换纯化单克隆抗体的实验报告.单克隆抗体通讯，1989;5(2):50

11段佩若，张励力，韩洪彦etal.碱性磷酸酶单抗及其复合物的制备及用于呼吸道病毒检测.中华流行病学杂志，1997;18(3-A):89

12段佩若，张励力，韩洪彦etal.应用系列呼吸道病毒单克隆抗体快速检测抗原的研究.中华流行病学杂志，1994;15(5):308

13段佩若，林京，韩洪彦.呼吸道合胞病毒单克隆抗体用于碱性磷酸酶桥联酶标快速诊断.中华医学检验杂志，1990;13(2):89

14张励力.免疫印迹技术对抗副流感1、3型单抗识别抗原表位的研究.中国免疫学杂志，1994;10(6):353

15盛锦云，王同权.小儿肺炎病毒学与临床研究.中华儿科杂志，1992;30(4):203

16董宗祈，陈志勤.儿童病毒性肺炎多病原检测分析.中华儿科杂志，1995;33(3):171

17阮力.呼吸道合胞病毒糖蛋白F和G在同一重组痘苗病毒中的表达.病毒学报，1992;8(2):101

18杜金林，王之梁.我国呼吸道合胞病毒抗原亚型初步探讨.微生物学报，1991;31(6):488

19段佩若，张励力，朱仁英.乙型流感局部爆发的调查.人民军医，1992;397(12):12

20段佩若，张励力，朱仁英.部队某营区乙型流感爆发流行的调查.中华实验和临床病毒学杂志，1994;8(增刊):117

21段佩若，张励力.1994年一起乙型流感爆发流行的调查.解放军预防医学杂志，1995;13(4):268