姜黄素衍抑制K562细胞增殖研究

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作者：李娜,吴丽贤,温彩霞,黄秀旺,许建华

【摘要】目的研究姜黄素衍生物Fm04对K562细胞的增殖及对P210bcr/abl信号通路的影响。方法应用MTT法检测姜黄素衍生物Fm04对K562细胞增殖的影响;应用Westernblot法检测P210bcr/abl及其下游通路蛋白表达的变化和线粒体细胞色素C的变化;比色法测定Caspase3、Caspase9活化程度。结果Fm04对K562细胞的抑制作用呈量效、时效关系,4μmol/LFm04作用24h,抑制率88.4%,半数抑制浓度1.45μmol/L,强度约为姜黄素的7倍;Westernblot表明Fm04可显著下调P210bcr/abl及其下游信号通路蛋白,减少细胞线粒体内细胞色素C含量;Fm04处理组Caspase3、Caspase9浓度值增加。结论Fm04显著抑制k562细胞的增殖并减少P210的蛋白含量从而下调P210bcr/abl下游多种信号分子表达,通过激活caspase的活化和线粒体内细胞色素C的释放,最终诱导K562细胞的凋亡。

【关键词】姜黄素;细胞凋亡;白血病,髓样,慢性;融和蛋白质类;bcrabl;K562细胞;信号传导

ABSTRACT:ObjectiveTostudytheapoptosisinducingeffectsofthesyntheticalcurcuminderivativeFm04onchronicmyelogenousleukemia(CML)cell.MethodsMTTwasusedtodeterminetheapoptoticeffectsofFm04onK562cells.ThesignalproteinmoleculesexpressedinK562cellswasexaminedbyWesternBlotting.ThespectrophotometerkitwasusedtodetecttheactivityofCaspase3andCaspase9.ResultsExposureofK562cellstoFm04producedbothconcentrationandtimedependentincreaseintheantiproliferativerate.K562cellsweremuchmoresensitivetofm04thantocurcumin,4μmoL/LFm04for24htheinhibitingratsreached88.4%andtheIC50ofFm04was1.45μmol/L.Moreover,thelevelofP2l0bcr/ablaswellasthedownstreamsignalproteinwasstronglydownregulatedinfm04treatedK562cells,andtheDvalueofCaspase3andCaspase9wasupregulatedinFm04treatedK562cells.ConclusionFm04exhibitsstrongeractivityininducingapoptosisinchronicmyelogenousleukemia(CML)cellsthancurcuminbyhavingstrongeractivityofthedownregulationoftheP2l0bcr/ablandotherproteins,andbyactivingthecaspasecascadesandinducingthestrongerreleaseofcytochromeCfrommitochondria.Fm04mightbeworthyofbeingconsideredasapotentialchemotherapeuticagentofCML.

KEYWORDS:curcuminderivative;apoptosis;leukemia;P210bcr/abl

姜黄素(curcumin,Cur)系从姜黄中提取的酚性有效单体化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗突变、抗炎、抗血小板聚集等广泛的药理作用[1]。近年来,有关姜黄素的药理学研究尤其在抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等方面的作用日益受到重视，并发现Cur与STI571体外联合应用可明显协同下调P210bcr/ab1的表达水平，这对于降低慢性粒细胞白血病对STI571的耐药性的一定的意义[2]。但姜黄素水溶性差,水溶液易水解,首过消除现象明显,生物利用度低,成为限制其临床应用的主要因素和产业化的瓶颈[3]。本实验保留分子中共扼β二酮链等活性必需基团,设计合成新的姜黄素衍生物Fm04。

P210bcr/abl融合蛋白定位于细胞质内,依靠Bcr的双聚体区,以形成二聚体。P210bcr/abl蛋白可通过其酪氨酸激酶(PTK)的持续激活而活化下游相关的信号转导通路,包括Ras/MAPK、PI3K、Erk、NFκB、JakSTAT通路等[49],并阻断线粒体内的细胞色素C(CytC)的释放引起caspases级联的激活[10],从而阻止细胞凋亡,导致细胞过度增殖,是治疗慢性粒细胞白血病的分子靶点。笔者以K562细胞为模型,对新合成姜黄素衍生物Fm04的体外抗慢性粒细胞白血病细胞活性进行初步评价及探讨。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1药品与试剂姜黄素(上海试剂三厂,批号980825),纯度99%;姜黄素衍生物Fm04由本实验室合成并提纯,经核磁共振光谱验证,经HPLC及薄层层析分析鉴定,纯度>90%;Westernblot试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司];抗ABL单克隆抗体、Erk1/2、pErk、AKT、pAKT、CytC、NFκB(P65)、βactin抗体(美国SantaCruz公司);Caspase3、Caspase9分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司)。

1.1.2细胞株及培养条件人慢性粒细胞白血病细胞株K562(中科院上海细胞研究所),培养于含10%新生牛血清,1×108U/L青霉素及100mg/L链霉素的RPMI1640培养液,在37℃、体积分数为0.05、饱和湿度的CO2培养箱培养。细胞接种24h后进入指数增长期。

1.2方法

1.2.1细胞增殖采用MTT法,观察Fm04对K562细胞作用的量效与时效关系,接种指数生长期的K562细胞于96孔板上,分别设置空白组,Fm04组（1,2,4,8μmol/L）,Cur组（5,10,20,40μmol/L）。将培养板置于37℃、体积分数为0.05、饱和湿度的CO2培养箱培养至所需的时间,加入MTT溶液,继续培养4h后,离心,弃上清,加入DMSO,颗粒完全溶解后用酶标仪在570nm处测定每孔的光密度值(D)。

1.2.2P210bcr/abl等信号蛋白表达采用Westernblot法,药物处理细胞24h,收集细胞,以0.01mol/L浴冷PBS(pH7.2)洗2次,加入去污裂解缓冲液于4℃裂解30min,离心,吸出上清,即为细胞总蛋白,用BCA蛋白定量,各组均采用同样的蛋白量上样,在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜,封闭液封闭过夜,加一抗室温作用1h,洗去未结合的一抗,以Westernblot试剂盒加二抗,DAB染色。

1.2.3Caspase3和Caspase9活性药物处理细胞24h,收集细胞,采用Caspase3、Caspase9分光光度法检测试剂盒,用分光光度计在λ=405nm测定其D值。通过计算D诱导剂/D阴性对照的倍数来确定Caspase3和Caspase9活化程度。

2结果

2.1Fm04对K562细胞增殖的抑制K562细胞增殖抑制率随Fm04浓度增大而提高,呈剂量依赖关系(图1A),其IC50为1.45μmol/L,强度约为姜黄素的7倍;K562细胞增殖抑制率随着Fm04作用时间的延长而提高,呈时间依赖关系(图1B),且低浓度Fm04在12,24及48h对K562细胞抑制率均比高浓度姜黄素高。

A:不同浓度Fm04和Cur;B:Fm044μmol/L和Cur10μmol/L.

图1Fm04对K562细胞增殖抑制的影响（略）

Fig1InhibitoryeffectofFm04onproliferationofK562cells福建医科大学学报2008年5月第42卷第3期李娜等：姜黄素衍生物Fm04抑制K562细胞增殖及其对P210bcr/abl信号通路的影响

2.2Fm04对K562细胞中P210bcr/abl及其下游信号通路蛋白的影响

2.2.1Fm04下调K562细胞P210bcr/abl蛋白含量随Fm04剂量增大,P210bcr/abl蛋白条带灰度逐渐变淡,Fm041μmol/L就可下调P210bcr/abl蛋白,Fm044μmol/L最明显,条带基本消失,呈量效关系(图2A)。Fm044μmol/L作用12h即对p210bcr/abl蛋白有抑制作用,随着时间的延长,条带逐渐变淡,至48h,P210bcr/abl蛋白条带几乎消失，可见明显的时效关系(图2B)。

A:Fm04;B:4μmol/LFm04.

图2Fm04对K562细胞P210bcr/abl蛋白含量的影响（略）

Fig2EffectofFm04onP210bcr/ablinK562cells

2.2.2Fm04对K562细胞P210bcr/abl下游相关信号通路蛋白含量的影响分别以Fm041,2,4μmol/L处理K562细胞12h,随着剂量增加,NFκB蛋白逐渐减少;而以Fm041,2,4μmol/L处理K562细胞24h,对于PAKT来说,随剂量增加,其蛋白含量减少;而对于PErk来说,其蛋白含量随剂量增加而增加(图3A)。用Fm044μmol/L分别处理K562细胞1,3,6,12,24,48h,PErk蛋白含量在1～6h。随时间延长而减少,处理6h蛋白基本消失,而12～48h,蛋白含量随着时间延长而逐渐增加,此现象于姜黄素并未发生。Cur40μmol/L处理K562细胞,0～48h内,PErk蛋白含量随时间变化逐渐减少(图3B)。

2.3Fm04对线粒体凋亡途径的影响

2.3.1Fm04触发K562细胞线粒体细胞色素C释放Fm041,2,4μmol/L处理K562细胞24h能促进K562细胞线粒体细胞色素C释放,细胞质S100中的含量逐渐增加,相反,线粒体中的细胞色素C含量逐渐减少(图4)。

2.3.2Fm04活化Caspase3、Caspase9Fm041,2,4μmol/L处理K562细胞24h后,Caspase3、Caspase9的活化程度增高,能将偶联有发色基团的Caspase3序列特异性的多肽底物被剪切,发色基团游离出来,D值升高。

3讨论

3.1Fm04下调K562细胞P210bcr/abl及其下游相关信号通路蛋白含量本实验合成的姜黄素衍生物Fm04,化学结构经1HNMR和13CNMR确证。细胞增殖抑制实验表明，Fm04对K562细胞有明显的抑制作用,呈量效和时效关系,其抑制活性明显优于姜黄素。P210bcr/abl是CML的特征性蛋白,具有异常活跃的酪氨酸激酶活性,是CML发病的主要原因,并与其对多种化疗药物耐药有关,且由于P210bcr/abl含有磷酸化位点,可与含SH2的信号分子相结合,从而活化下游相关的多条信号途径[49],促进细胞增殖。从实验结果表明,新合成姜黄素衍生物Fm04可下调K562细胞P210bcr/abl含量并呈量效和时效关系;Fm04还可下调与K562细胞增殖和凋亡有关的P210bcr/abl下游信号分子pErk(如6h)、pAKT、NFκB。

A:不同剂量Fm04;B:不同时间Fm04及Cur.

图3Fm04对K562细胞P210bcr/abl下游相关信号分子的影响（略）

Fig3EffectofFm04onthebcr/ablrelatedsignalingmoleculesinK562cells

图4Fm04对K562细胞线粒体细胞色素C(CytC)的影响（略）

Fig4EffectofFm04oncytochromeCofmitochondriainK562cells

图5Fm04对K562细胞Caspase3和Caspase9活化程度的影响（略）

Fig5EffectofFm04onactivationofCaspase3andCaspase9inK562cells

3.2Fm04对K562细胞PErk的影响细胞外调节蛋白激酶(ERK)分为ERK1和ERK2,统称为ERK1/2,主要被各种生长因子、离子射线、过氧化氢等磷酸化而激活,进入细胞核作用于E1k1,cmyc,cfos,cjun,ATF,NFκB和AP1等转录因子,促进某些基因的转录与表达,和细胞的增殖与分化密切相关。本实验结果表明,Fm04作用K562细胞24h,pErk蛋白含量随Fm04剂量增大而增加(图3A),而细胞增殖实验结果显示(图1)Fm04对K562细胞的增殖有很强的抑制作用,通过观察不同时间点Fm04对pErk蛋白表达的影响发现,Fm04作用于K562,早期引起pErk减少,而晚期引起其增多,Chunrong等发现Sti571作用于bcr/abl阳性细胞也有类似状况[11]。有报道显示,细胞外信号调节激酶(ERK)1/2是Ca2+/CaM信号通路的重要调节因素[1213],许多Ca2+/CaM抑制剂均可引起(ERK)1/2的持续磷酸化并抑制细胞增殖。Shim合成研究的姜黄素衍生物HBC可通过引起HCT15细胞(ERK)1/2的持续磷酸化而阻断Ca2+/CaM信号通路而抑制细胞增殖[14],因此可推断Fm04除了P210bcr/abl信号通路,或许对Ca2+/CaM信号通路也有一定的抑制作用,该方面机制有待进一步研究。

3.3Fm04对K562细胞Caspase3和Caspase9的影响Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,Caspase9是级联酶的上游分子,在正常状态下以酶原的形式存在于细胞浆中,没有活性,可被从线粒体向细胞质释放的细胞色素C激活。Caspase3在正常状态下以酶原的形式存在于细胞浆中,没有活性;但在细胞发生凋亡阶段,它被激活,活化的Caspase3由两个大亚基和两个小亚基组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。Fm04可促进细胞色素C从线粒体释放放入细胞质,活化Caspase9和Caspase3,激活下游的凋亡通路。

笔者认为,新合成姜黄素衍生物Fm04可显著抑制K562细胞增殖并下调P210bcr/abl信号通路,具有显著的体外抗慢性粒细胞白血病活性,笔者将进行进一步的在体实验,为进一步改造开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定基础。

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