吡格列酮对游离脂肪酸介导思考

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【摘要】目的研究吡格列酮对游离脂肪酸(FFA)诱导的小鼠胰岛βTc3细胞凋亡的影响及其作用机制。方法以βTc3细胞为研究对象,分为对照组及FFA组(0.25,0.5,1.0mmol/L)。检测不同浓度FFA干预后βTc3细胞的增殖抑制率、细胞周期、细胞凋亡率;检测吡格列酮对FFA诱导的βTc3细胞凋亡的干预作用。结果FFA干预后的βTc3细胞增殖抑制率随FFA作用时间延长、浓度增加而进行性增加。各浓度FFA干预24h后βTc3细胞周期于G1/S检测点明显阻滞,凋亡细胞比例增加。吡格列酮干预FFA诱导的βTc3细胞后24h,βTc3细胞周期阻滞减少,凋亡细胞比例明显减少。结论FFA水平异常不利于胰岛βTc3细胞生存,并可诱导βTc3细胞凋亡;吡格列酮有助于维护在FFA诱导下的胰岛βTc3细胞的生存能力,并避免或减少其凋亡。

【关键词】噻唑烷二酮类脂肪酸类菲酯化胰岛糖尿病2型细胞凋亡

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofpioglitazoneonFFAinducedapoptosisofβTc3cell,apancreaticβcelllineinvitro.MethodsβTc3wassubjecttodifferenttreatmentswithablankandthreekindconcentrationsofFFA,thatwere0.25,0.5and1.0mmol/LFFA.TheMethodofMTTwasusedtomeasuretheproliferationinhibitionratesforsuccessivethreedaysafterFFAintervention.Thechangesofcellcycleweredetected24hoursaftertreatmentbyaflowcytometry.TUNELwasusedtodeterminetheapoptosisrateofcells24hoursaftertreatment.TUNELandflowcytometrywereusedtodetermineinterventioneffectofPioglitazoneontheapoptosisofβTc3cellinducedbyFFA.ResultsInhibitionofβTc3wasincreasedwithprolongedtreatmentofFFAandincreasedFFAconcentrations.FlowcytometryanalysisshowedthatcellcycleofβTc3celltreatedwithFFAofalltheconcentrationwasblockedinphaseofG1/S.ThepercentageofβTc3cellapoptosissubstantiallyincreasedduetoFFAtreatment.NoobviousabnormalchangeofcellcycleofβTc3cellandasubstantiallydecreaseofpercentageofapoptosiscellsafterpioglitazoneintervention.ConclusionAbnormalFFAlevelisextremelyharmfulforsurvivalofβTc3cellculturedinvitro,butpioglitazonecouldmaintainthesurvivingabilityofinsulinβTc3celldamagedbyFFA.

KEYWORDS:thiazolidinediones;PPARgamma;fattyacids,nonesterified;diabetesmellitus,type2;apoptosis

福建医科大学学报2008年7月第42卷第4期程惠希等：吡格列酮对游离脂肪酸介导的βTc3细胞凋亡的干预作用2型糖尿病是糖尿病的主要类型,但其发病机制尚未阐明。迄今的研究显示,胰岛β细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病主要病理生理基础,而游离脂肪酸(freefattyacids,FFA)水平异常可能为重要的致病因素,长期暴露于高FFA可引起人和鼠胰岛β细胞脂质过载,细胞增殖下调和凋亡增加,胰岛素分泌减少[13]。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisomeproliferatorsactivatorreceptorsgamma,PPAR)是一类由配体激活的核内受体转录因子超家族成员,存在3种亚型,即PPARα、PPARβ和PPARγ。笔者既往研究显示,PPARγ高表达可保护胰岛βTC3细胞免于FFA介导的损伤[4]。噻唑烷二酮类药物(thiazolidinedionecompounds,TZD)是PPARγ的高亲和力配体,也是重要的抗糖尿病药物。笔者应用TZD类药物——吡格列酮干预FFA对βTC3细胞的有害影响,以期进一步分析FFA水平异常介导β细胞损害的机制及为吡格列酮的抗糖尿病作用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

βTC3细胞源自转基因小鼠的胰岛素瘤细胞(福建医科大学分子医学中心惠赠);RPMI1640培养基(美国Gibco公司)培养,内含10％小牛血清、2mmol/L的L谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素;油酸、棕榈酸(美国Sigma公司);吡格列酮(江苏德源药业有限公司);甲基偶氮唑蓝(MTT,厦门泰京生物有限公司);TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)。

1.2方法

1.2.1FFA制备

FFA贮备液中油酸与棕榈酸的比例为2∶1。溶解所需剂量的油酸和棕榈酸于99%乙醇10mL,振摇1h。每10mmol/LFFA加入0.4g/mLNaOH40μL,混匀,置于通风橱中过夜干燥。后加入蒸馏水10mL,加热溶液至透明皂液样时,加入10%冷小牛血清40mL,混匀。经0.22μmCA过滤器过滤消毒后贮存于-20℃备用。

1.2.2吡格列酮配制

吡格列酮5mg用二甲亚砜(DMSO)溶解,再用DMSO溶液稀释配置成1mmol/L的母液,过滤除菌,4℃保存,使用前用RPMI1640培养基稀释,培养基中DMSO终浓度≤0.01％。

1.2.3MTT法测定FFA对βTc3细胞的影响

取对数生长期的βTc3细胞接种于96孔培养板,温育24h后吸去上清液,每孔加含10%小牛血清的RPMI1640培养基180μL。继续温育24h后,药物组每孔加不同浓度的FFA20μL,使其工作浓度分别为0.25,0.5,1.0mmol/L,对照组加等量的含10%小牛血清的RPMI1640培养基。反应结束前4h吸去培养上清液,每孔加5mg/mL的MTT溶液50mL。继续培养4h后,吸去MTT溶液,每孔加入DMSO150μL充分溶解MTT还原产物。于酶标仪上检测490nm波长光密度值(D)。测定FFA干预后12,24,48h的细胞D值,绘制各组细胞生长曲线,取各组平均值计算细胞生长抑制率。

1.2.4流式细胞仪测定βTc3细胞周期

取对数生长期的βTc3细胞接种于6孔培养板,分别设置对照组、A组(FFA0.25mmol/L)、B组(FFA0.5mmol/L)、C组(FFA1mmol/L)。培养细胞24h后以0.25％的胰蛋白酶充分消化细胞,500～1000r/min离心5min,弃去培养液。PBS3mL洗涤1次,离心去PBS,加入预冷的70％乙醇固定,4℃1h。离心弃去固定液,PBS3mL重悬5min。400目筛网过滤1次,500～1000r/min离心5min,弃去PBS。用碘化丙啶1mL染液,4℃避光30min。于流式细胞仪上检测各组细胞周期。

1.2.5TUNEL法检测细胞凋亡

(1)培养细胞并加不同浓度的FFA,24h后经空气干燥后用4%多聚甲醛溶液固定,PBS洗片后,与0.3%H2O2甲醇溶液室温孵育。(2)PBS洗片,与通透液在冰浴中孵育2min。(3)PBS冲洗2次,滴加TUNEL反应混合液50μL,对照组以PBS缓冲液取代TUNEL反应混合溶液,在湿盒中37℃孵育60min。(4)PBS冲洗3次,加入转化剂POD50μL,在湿盒中37℃孵育30min。PBS冲洗3次,加入DAB底物溶液,室温孵育10min。DAB显色凋亡阳性细胞后(凋亡阳性细胞核呈棕黄色),苏木精对比染色阴性细胞核。每份样品于高倍镜下随机选取5个视野,计数100个细胞核,计算凋亡细胞百分率。

凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%

1.2.6流式细胞仪检测吡格列酮对细胞凋亡的干预作用

取对数生长期的βTc3细胞接种于6孔培养板,设置FFA1mmol/L组和100μmol/L吡格列酮+FFA1mmol/L组。培养细胞24h后以0.25％胰蛋白酶充分消化细胞,离心、PBS洗涤、离心,收集细胞,PBS洗涤后过滤,于流式细胞仪上检测各组细胞周期。

1.2.7TUNEL法检测吡格列酮对细胞凋亡的干预作用

培养细胞,设置FFA1mmol/L组和吡格列酮100μmol/L+FFA1mmol/L组,24h后同前述方法检测βTc3细胞凋亡,计算凋亡细胞百分率。

1.3统计学处理

实验数据以x±s表示,SPSS10.0软件处理数据。组间差异采用方差分析,各实验组与对照组比较采用Dunnettt检验,P<0.05为差别有统计学意义。

2结果

2.1MTT分析FFA诱导的βTc3细胞的增殖活性变化

不同浓度的FFA作用于βTc3细胞12,24,48h后,MTT法测定各组细胞D值。与对照组比较,FFA0.25mmol/L诱导12h后的细胞增殖活性无明显降低(P＞0.05);0.5mmol/L和1mmol/LFFA诱导12h后的细胞增殖活性明显降低(P<0.05);不同浓度FFA诱导24,48h后的细胞增殖活性与对照组比较均明显降低,细胞增殖抑制率上升。FFA对于βTc3细胞的增殖抑制作用具有明显的时间和浓度依赖性(表1)。表1FFA诱导后MTT检测的增殖抑制率（略）

2.2流式细胞仪测定FFA诱导后24h细胞周期

0.25,0.5,1mmol/LFFA作用于βTc3细胞24h后,各浓度FFA对于细胞周期具有明显的G1/S阻滞作用。随浓度增加,G1期(DNA合成前期)细胞明显增多,S期(DNA合成期)细胞明显减少,FFA阻滞细胞周期具有明显的浓度依赖性。与对照组比较,差别有统计学意义(表2)。1mmol/LFFA诱导的βTc3凋亡明显,加入100μmol/L的吡格列酮干预1mmol/L的FFA诱导的βTc3细胞24h后,吡格列酮干预组的βTc3细胞的细胞周期的G1/S阻滞作用明显减少,与未干预组比较,差别有统计学意义(P<0.05,表3)。表2FFA诱导24h后βTc3细胞周期（略）表3吡格列酮和FFA对βTc3细胞周期的影响（略）

2.3TUNEL法检测FFA诱导的细胞凋亡

0.25,0.5,1mmol/L的FFA作用于βTc3细胞24h后,TUNEL实验表明上述各浓度FFA均可诱导βTc3细胞凋亡,且呈明显的浓度依赖性,与对照组相比差别有统计学意义。加入100μmol/L的吡格列酮干预1mmol/L的FFA诱导的βTc3细胞24h后,βTc3细胞的凋亡细胞比例(40.30±3.40）%,较未干预组(77.20±2.30）%明显减少,差别有统计学意义(P<0.05,图1)。

3讨论

近年对2型糖尿病发病机制的研究已取得很大进展,多数学者认为胰岛β细胞的进行性衰竭是2型糖尿病的发生发展的决定因素。但β细胞功能缺陷的机制目前尚未完全阐明。肥胖者脂肪组织分解产生的FFA明显增加,而FFA不仅参与了胰岛素抵抗的发生,也被证实可损害β细胞功能,并可导致β细胞凋亡[2,5]。PPARγ是脂肪细胞分化的重要调节因子,也是新一代的抗糖尿病药物TZD的作用靶分子。已知FFA可作为配体与PPARγ结合,激活PPARγ,使Caspases蛋白表达增高,引起细胞凋亡[2,6],但具体途径不明。文献显示,β细胞也有PPARγ表达。笔者前期研究表明,高水平的FFA对βTc3细胞的生存能力有明显的抑制作用,表现为细胞生存率降低或出现凋亡,进一步提示FFA对胰岛β细胞的损害可能是2型糖尿病患者胰岛β细胞功能失代偿的原因之一。

本研究中,笔者应用PPARγ的激动剂——吡格列酮干预FFA对βTc3细胞的损害,结果显示具有明显的保护细胞免于FFA的损害,可使βTc3细胞的凋亡明显减少,提示吡格列酮与PPARγ结合后,抑制FFA诱导的β细胞凋亡,表明FFA与PPAR间的反应可能参与胰岛β细胞的凋亡。TZD还也可限制β细胞内TG的堆积,改善这些组织的功能,并可使β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌有所恢复,继而预防β细胞的凋亡。TZD可增加前脂肪细胞的分化和成熟,增加脂肪细胞的数量,储存更多的TG,减少循环中FFA水平及非脂肪组织FFA的流入,还可以降低非脂肪组织内原有的脂肪高合成代谢,其关键酶表达下调,从而降低细胞内TG含量,对TG在β细胞内堆积引起的β细胞功能障碍起到保护作用[7]。笔者既往研究发现,TZD可抑制NFκB的活性保护β细胞免于TNFα诱导的细胞凋亡[8],此次研究显示吡格列酮保护βTc3细胞免于FFA诱导的细胞凋亡，是否与抑制NFκB的活性有关值得探讨。

【参考文献】

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[8]杨立勇,杨永年,陈志坚.转录因子NFκB在肿瘤坏死因子α介导的胰岛β细胞凋亡中的作用[J].中华医学杂志,2003,83(8):688669.