异十三基二胺体内外抗肿瘤作用

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【关键词】抗肿瘤药;,肿瘤细胞,培养的;,肿瘤移植;,异十三基二胺

摘要:目的观察异十三基二胺(D79)的体内外抗肿瘤作用。方法应用锥虫蓝排染法、MTT法检测D79对多种体外培养肿瘤细胞的细胞毒作用;Bliss法观察D79急性毒性实验;在可耐受剂量下观察D79对小鼠移植性实体瘤U14、腹水瘤EAC、HAC的抑制率。结果D79显著杀伤多种体外肿瘤细胞,药物作用48h,IC501.24~3.36μg/mL;D79的LD50为36.49mg/kg(静脉注射)。D79抑制小鼠移植性实体瘤U14体内生长、提高移植性腹水瘤EAC、HAC小鼠生存时间的作用呈剂量依赖性。结论D79有较强的体内外抗肿瘤作用。

关键词:抗肿瘤药;肿瘤细胞,培养的;肿瘤移植;异十三基二胺

ABSTRACT:ObjectiveToobservetheantitumoreffectofallotritridecyldiamidogen(D79)invivoandinvitro.MethodsThecytotoxiceffectsofD79onvarioustumorcellslinesculturedinvitroweredeterminedbytrypanbluedyeexclusiontest,MTTmethod.AcutetoxicityofD79wasevaluatedbyBlissmethod:atatolerabledoselevel,D79wasadministratedtotreattransplantedsolidtumorU14andascetictumorsEACandHAC.Tumorweightinhibitionandlifeextensionwereobserved.ResultsD79inducedsignificantgrowtharrestinvariousmalignanttumorcelllinesculturedinvitro.IC50ofthesetumorcellsexposedtothedrugfor48hoursrangedfrom1.24~3.36μg/mL.LD50ofD79was36.49mg/kg(mice,iv).D79inhibitinvivogrowthofimplantedsolidtumorU14andprolongedlivetimeimplantedascetictumorsEACandHACofmiceinadosedependmentmanner.ConclusionD79hadobviousantitumoractivityinvivoandinvitro.

KEYWORDS:antineoplasticagents;tumorcells,cultured;neoplasmstransplantation;allotritridecyldiamidogen

2000年,Yang等证实末端支链饱和脂肪酸13甲基肉豆蔻酸(13MTD)体内外抗肿瘤作用并发现其主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用[1]。异十三基二胺(D79)是在13MTD基础上合成的一种新型胺类化合物,其化学结构明显区别于当前常规抗肿瘤药物。笔者研究其体内外抗肿瘤作用,初步结果报告如下。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1药品

2%D79溶液(福建省振华851生物制药有限公司,批号040507);RPMI1640培养基干粉(美国Gibco公司);小牛血清(美国HyClone公司);胰蛋白酶(美国Difco公司);锥虫蓝及噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司);环磷酰胺(上海华联制药厂生产,批号040202);氟尿嘧啶(250mg/10mL,天津金耀氨基酸有限公司,批号0501182);其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2仪器

6孔及96孔细胞培养板(美国Coster公司);生物安全柜(HFSafe1200型)及气体培养箱(BB5060,上海力申科学仪器有限公司);全自动酶标仪(Mod550,美国BioRad公司);倒置显微镜及正置显微镜(日本Olympus公司);微量称质量仪(BP221S,德国Sartorius公司);电子天平(TD6001B,余姚市金诺天平仪器有限公司);振荡器(2002型,常州国华电器有限公司)。

1.1.3动物及瘤株

昆明种小鼠,体质量(20±2)g,雌雄不限,由福建医科大学实验动物中心(合格证号:医动字2306号)。每次实验使用同一性别小鼠。小鼠子宫颈癌实体型瘤株(U14)、小鼠艾氏腹水瘤(EAC)及肝癌腹水瘤(HAC)均引自福建医科大学药学系。

1.1.4肿瘤细胞

人慢性粒细胞白血病细胞株(K562)、人早幼粒白血病细胞株(HL60)、小鼠黑色素瘤细胞株(B16)、人肝癌细胞株(HEPG2)、人胃腺癌细胞株(SGC7901)均引自福建医科大学药学系。

1.2方法

1.2.1细胞培养

K562、HL60、B16、HEPG2、SGC7901细胞株培养于含10%小牛血清、青霉素100IU/mL、链霉素100μg/mL的RPMI1640培养液中,每3天换液一次,每5天传代一次。细胞均置于37℃、体积分数为0.05的CO2,饱和湿度的气体培养箱中。

1.2.2锥虫蓝排染法

取对数生长期的HL60、K562细胞,以全培养液稀释成5×104mL1单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板,每个浓度复种4孔,每孔190μL,置于气体培养箱培养。12h后D79组每孔加不同浓度D7910μL,对照组加等量溶剂。共培养48h后每孔加0.4%锥虫蓝100μL,染色5min。计数各组拒染活细胞数,按下式计算抑制率：

抑制率%=(1药物组活细胞数/对照组活细胞数)×100%

直线回归法测该药的半数抑制浓度(IC50)。实验重复3次[2]。

1.2.3MTT法

取对数生长期的B16、HEPG2、SGC7901细胞,0.25%胰酶PBS液消化后,全培养液稀释成5×104mL1单细胞悬液,接种于96孔细胞培养板,每个浓度复种4孔,每孔190μL。置于气体培养箱内,12h后D79组每孔加不同浓度D7910μL,对照组加等量溶剂,共培养48h。反应结束前4h每孔加入MTT(1mg/mL)50μL。继续培养4h,吸尽上清,每孔加入DMSO200μL充分溶解MTT还原产物。酶标仪550nm检测光密度(Dλ)并计算抑制率。直线回归法计算IC50。实验重复3次[2]。

抑制率%=[1药物组D(550nm)值/对照组D(550nm)值]×100%

1.2.4D79急性毒性实验

根据文献[3]方法,小鼠静脉注射(iv)不同剂量D79,连续观察7d。

1.2.5小鼠移植性肿瘤接种及传代

1.2.5.1U14实体瘤接种传代[4]

取肿瘤生长旺盛的小鼠,无菌操作摘取实体肿瘤,称质量,按1∶4比例加入无菌生理盐水,磨成匀浆,取0.2mL接种于小鼠右腋部皮下。

1.2.5.2EAC、HAC腹水瘤接种传代[4]

取肿瘤生长旺盛的小鼠,无菌操作抽取腹水,称体积后按1∶4比例加入无菌生理盐水,取0.2mL接种于小鼠腹腔内。

1.2.6D79对小鼠移植性肿瘤的抑制作用

根据急性毒性实验结果,选择3个剂量(10.0,7.0,4.9mg・kg1・d1)连续腹腔注射(ip)。接种肿瘤后按体质量随机分组,设阴性对照组、阳性对照组及D79组。阳性对照组给予环磷酰胺或氟尿嘧啶[1，3],阴性对照组给予等量溶剂,D79组按给予剂量分为高、中、低剂量组;于接种当日开始给药(ip),连续10d。U14荷瘤小鼠于实验第12天取瘤称质量,计算瘤质量抑制率。EAC、HAC荷瘤小鼠记录实验小鼠生存时间,并计算生命延长率。

瘤质量抑制率%=(1药物组平均瘤质量/阴性对照组平均瘤质量)×100%

生命延长率%=(药物组平均生存时间/阴性对照组平均生存时间1)×100%

1.3统计学处理

数据以x±s表示。采用SPSS11.5统计软件处理,差异显著性检验采用方差分析。

2结果

2.1D79对多种肿瘤细胞的体外细胞毒作用

D790.25~4.00μg/mL作用48h,对多种体外培养肿瘤细胞均产生显著杀伤作用,抑制率随药物剂量的增加而升高,IC501.24~3.36μg/mL(表1)。表1D79对肿瘤细胞的体外细胞毒作用（略）

2.2D79小鼠急性毒性实验

小鼠ivD79后未发现明显异常。死亡小鼠解剖观察主要脏器未发现明显异常。D79急性毒性实验结果见表2。表2小鼠静脉注射D79急性毒性实验（略）

2.3D79对小鼠移植性肿瘤U14的抑制作用

结果见表3。表3D79对小鼠移植性肿瘤U14的抑制作用（略）

2.4D79对小鼠移植性肿瘤EAC、HAC的抑制作用

结果见表4。表4D79对小鼠移植性肿瘤EAC、HAC的抑制作用（略）

3讨论

恶性肿瘤是本世纪人类面临最大威胁的疾病之一。目前临床常用抗肿瘤药物广泛存在对肿瘤选择差、毒副作用大以及易产生耐药性等缺点，因此,寻找疗效好、毒副作用小的新型抗肿瘤药已成为人类战胜恶性肿瘤的当务之急。D79是在13MTD基础上合成的一种新型胺类化合物,其化学结构明显区别于当前常规抗肿瘤药物[5],因此可能不易与临床常规抗肿瘤药物发生交叉耐药。

13MTD对多种体外培养肿瘤细胞具有杀伤作用,抑制裸鼠原位移植人前列腺癌细胞株及肝癌细胞株肿瘤的生长,其体内外抗肿瘤作用主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用[1]。本实验中,D79对K562、HL60、B16等5种体外培养肿瘤细胞均有显著杀伤作用,并且作用呈剂量依赖性。对人早幼粒白血病细胞株HL60最敏感,对人肝癌细胞株HEPG2最不敏感,平均IC50在1.24~3.36μg/mL。D79小鼠急性毒性实验结果Bliss法计算LD50=36.49mg/kg(iv),其LD95是32.34~41.18mg/kg(iv)。D79在可耐受剂量下,其对小鼠移植性宫颈癌U14实体瘤和肝癌HAC及EAC腹水瘤亦有明显的剂量依赖性抑制作用。D79体内外抗肿瘤作用明显强于13MTD[1]。D79是在13MTD基础上合成的一种新型胺类化合物,因此笔者推测D79可能亦通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。

D79有较强的体内外抗肿瘤作用,有望成为一种广谱、强效、毒性小的新型抗肿瘤药物,笔者将进一步研究其抗肿瘤作用机制。

参考文献：

[1]YangZH,LiuSP,ChenXD,etal.Inductionofapoptoticcelldeathandinvivogrowthinhibitionofhumancancercellsbyasaturatedbranchedchainfattyacid13methyltetradecanoicacid[J].CancerRes,2000,60(3):505509.

[2]林心建,黄自强,李常春.洋地黄毒甙体外抗人癌细胞株的作用[J].福建医学院学报,1996,30(1):1718.

[3]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社,1991:201206.

[4]吴国土,林建忠,王瑞幸,等.桂苓散的抗癌作用[J].福建医科大学学报,2003,37(1):8991.

[5]潘启超,胥彬.肿瘤药理学与化学治疗学[M].2版.郑州:河南医科大学出版社,2000:99325.