医学毕业论文:氟西汀对海马神经元生长的影响

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【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠

氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。

1材料与方法

1.1新生大鼠海马神经元的分离和培养

技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank''''s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量0.25%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。

1.2大鼠海马神经元的鉴定

1.2.1烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色

取培养6d6孔培养板中的盖玻片进行神经元特异的NSE免疫组织化学染色。弃去培养液，4%多聚甲醛室温固定1h，加入0.3%H2O2甲醇去除内源性过氧化氢酶，0.1%TritonX-100破膜，10%绵羊血清封闭，加入一抗1∶200兔抗鼠NSE抗体，4℃湿盒过夜，0.01mmol·L-1PBS清洗，加入二抗1∶200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37℃温箱孵育60min;0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加SABC过氧化物酶复合物，37℃温箱中孵育60min，0.01mmol·L-1PBS清洗，滴加DAB显色液作用3～10min，自来水冲洗后，常规脱水，透明封片。光镜下观察NSE表达阳性细胞。

1.2.2尼氏染色

6孔培养板的细胞培养7d时，取出盖玻片进行尼氏染色。弃去培养液，0.01mmol·L-1PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定1h，0.01mmol·L-1PBS清洗3次，氯仿中1min，95%、70%乙醇各1min，蒸馏水清洗，置于1%甲苯胺蓝染液中染色20min，95%乙醇分化，在显微镜下观察控制，时间以尼氏体显示清晰为准，37℃干燥，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

1.3实验分组

在培养的第3天加入氟西汀（常州第四制药厂生产），根据药物浓度不同，将实验细胞分为5组，分别加入1、10、20、40μmol·L-1氟西汀;正常对照组加入等体积的培养基。

1.4海马细胞形态定量分析

倒置相差显微镜（德国Zeiss公司产品）下观察加药48h后的海马神经元形态，每组各孔随机选择20个视野（每个视野0.17mm2），记录每个视野内细胞长出突起的神经元数目，目镜测微尺随机测量15个神经元突起的长度和胞体的长径。

1.5统计学处理

应用SPSS12.0软件进行统计分析，各项检测结果以x-±s表示。多组比较及组间两两比较采用方差分析。

2结果

2.1海马神经元形态学观察

倒置相差显微镜下观察，培养1d，细胞绝大部分贴壁，细胞形态大小不一，以单突起的小细胞为主。培养6d，神经元胞体较大，突起进一步增多、延长，并形成稀疏的网络（图1）。培养12d，神经元胞体进一步增大，突起形成比较稠密的网络。培养24d，神经元胞体出现空泡，部分神经元死亡，胞体崩解，突触断裂。

2.2海马神经元鉴定

NSE免疫细胞化学染色:染色后光镜下观察第6天的神经细胞，胞浆和突起被染成棕黄色为NSE抗体表达阳性细胞，以3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度，经鉴定神经元的纯度为90%。见图2A。

2.3氟西汀对海马神经元形态学的影响

结果见表1和图3。不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。表1氟西汀对加药48h海马神经元形态学的影响（略）

3讨论

本实验严格控制胰酶的量和消化时间，采用了0.25%胰蛋白酶低浓度溶液、30min长时间消化的方法，尽可能减少分离过程中的化学损伤。为了避免操作过程中的机械损伤，分离时动作轻柔，规律换药，每72h半量换液1次，换液时速度快，以减少对神经元生长的影响。本实验采用了差速贴壁生长，去除了成纤维细胞，并采用B27无血清培养基，可以选择性地促使神经元生长，抑制非神经元的生长和繁殖［3］，从而可以纯化海马神经元。NSE是神经元分化成熟的特异性标志酶之一，它主要表达于神经元的胞体、轴突、树突部分［4］，通过NSE免疫细胞化学染色方法，可以鉴定体外培养的新生大鼠海马神经元及其纯度。本实验通过NSE免疫化学染色，发现大部分细胞胞浆和突起被染成棕黄色，计数阳性细胞百分率为90%。尼氏体是神经元的特征性结构之一，存在于神经元胞体和树突内，可被碱性染料染成深色的颗粒和斑块，它是细胞内的一种蛋白质合成装置，可作为观察神经细胞功能状态的灵敏指标。本实验观察到培养的海马神经元胞质内尼氏体数量较多，说明培养的海马神经细胞生长良好。NSE免疫细胞化学染色和尼氏染色结果提示，本实验能培养出纯度较高、生长良好的海马神经元。氟西汀不仅是广泛应用的抗抑郁药，而且可以用于治疗癫痫、偏头痛、认知障碍、焦虑障碍、儿童孤独症等诸多神经精神疾病。目前研究认为，氟西汀抗抑郁效应与它对海马的神经保护作用有关，这种作用可能是通过促进海马细胞增殖来抵抗神经元的萎缩和丢失来实现的。李鹂等［1］研究发现，氟西汀在显著改善抑郁大鼠抑郁行为的同时，增加了海马齿状回神经前体细胞的数目，其增殖也增强，推测促进海马神经元再生可能是氟西汀治疗抑郁症的机制之一。李云峰等［5］通过慢性应激建立小鼠抑郁模型，认为氟西汀促进海马齿状回神经元再生可能是抗抑郁剂共同作用机制之一，并且可能与提高海马BDNF水平密切相关。一些临床研究的结果也提示抗抑郁药具有神经保护作用。Santarelli等［6］

研究发现5-HT再摄取抑制剂能部分逆转认知功能障碍大鼠海马齿状回神经元增殖减少及树突萎缩，并能促进海马神经元的再生和存活。Yatte等［7］通过高分辨率的MRI和立体定位方法测定海马容量，发现持续性接受抗抑郁药物治疗与只在发作时接受治疗的患者相比，海马容量无显著性降低。

本研究首次以体外培养的新生SD大鼠海马神经元为模型，通过细胞形态定量分析，探讨氟西汀对海马神经元生长的影响。Chiou等［8］通过MTT方法，发现浓度在55μmol·L-1以下的氟西汀可明显促进海马神经干细胞存活，在20μmol·L-1时达到高峰。根据Chiou等［8］的研究结果，本实验选择了浓度分别为1、10、20、40μmol·L-1的氟西汀来干预海马神经元。结果发现不同浓度的氟西汀对海马神经元形态学指标的影响是不同的，10μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起的神经元数目增加、最长突起长度增长（P<0.05）;40μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目减少（P<0.05），最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）;1、20μmol·L-1氟西汀组海马神经元与正常对照组相比，有突起神经元数目、最长突起长度及胞体长径无显著性差异（P>0.05）。结果表明氟西汀对海马神经元生长的影响有浓度依赖性，浓度过低（1μmol·L-1）对海马神经元生长的作用不明显，适当浓度（10μmol·L-1）可以促进海马神经元的生长发育，浓度过高（40μmol·L-1）则抑制海马神经元的生长。本实验中氟西汀浓度为40μmol·L-1即出现对海马神经元的抑制作用，与Chiou等［8］研究结果不完全一致，表明氟西汀对海马神经元和神经干细胞的影响存在差异。氟西汀促海马神经元生长的机制尚不明了，有研究［9］表明，长期给予氟西汀后，大鼠海马神经元的脑源性神经营养因子（BDNF）mRNA表达明显高于对照组，而BDNF具有很强的刺激和促进神经细胞生长和分化，维持神经细胞存活和正常功能的作用，Dwivedi等［10］发现氟西汀不仅能够增加海马BDNFmRNA的表达，还可以逆转皮质酮导致的海马BDNFmRNA表达的降低。据此可以推测，氟西汀促海马BDNF表达可能是促海马神经元生长的机制之一。非营养因子家族，包括睫状神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、成纤维细胞生长因子等，都能促进海马神经元的生长，氟西汀是否也可能通过上调这些因子的表达而促进海马神经元的生长有待研究。

本实验结果提示，氟西汀可以促进新生大鼠海马神经元的生长，这为氟西汀治疗与海马损害有关的神经精神疾病提供实验基础和理论依据。氟西汀促海马神经元生长的确切机制尚待进一步探讨。

【参考文献】

［1］李鹂，涂自良，杜士明，等.氟西汀对实验性抑郁症大鼠抑郁行为及海马神经元再生的影响［J］.医药导报，2006，25（4）:280-282.

［2］BrewerGJ.Isolationandcultureofadultrathippocampalneurons［J］.JNeurosciMethods，1997，71（2）:143-155.

［3］BrewerGJ，TorricelliJR，EvegeEK，etal.Optimizedsur-vivalofhippocampalneuronsinB27-supplementalneuron-basal，anewserum-freemediumcombination［J］.JNeurosciRes，1993，35（5）;567-576.

［4］SchmechelDE，BrightmanMW，MarangosPJ.Neuronsswitchfromnon-neuronalenolasetoneuron-specificenolaseduringdifferentiation［J］.BrainRes，1980，190（1）:195-214.

［5］李云峰，刘艳芹，张有志，等.抗抑郁剂对慢性应激小鼠海马神经元再生的影响［J］.中国药理学通报，2004，20（4）:385-388.

［6］SantarelliL，SaxeM，GrossC，etal.Requirementofhipp-ocampalneurogenesisforthebehavioraleffectsofantide-pressants［J］.Science，2003，301（5634）:805-809.

［7］YatteI，ShelineMD，MokhtarH，etal.Untreateddepressionandhippocampalvolumeloss［J］.AmJPsychiatry，2003，160（7）:1516-1518.

［8］ChiouSH，ChenSJ，PengCH，etal.Fluoxetineup-regu-latesexpressionofcellularFLICE-inhibitoryproteinandin-hibitsLPS-inducedapoptosisinhippocampus-derivedneuralstemcell［J］.BiochemBiophysResCommun，2006，343（2）:391-400.

［9］许珂，张永亮，郁缪宇，等.氟西汀对大鼠海马脑源性神经营养因子基因表达的作用［J］.中国药理学通报，2000，16（4）:453-455.

［10］DwivediY，RizaviHS，Pandey，GN.Antidepressantsre-versecorticosterone-mediateddecreaseinbrain-derivedneu-rotrophicfactorexpression:Differentialregulationofspecif-icexonsbyantidepressantsandcorticosterone［J］.Neuro-science，2006，139（3）:1017-1029.