低钾加重大鼠心肌细胞再灌注损伤的机制

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【关键词】低钾；钠

MechanismoflowK+bufferaggravatingreperfusioninjuryinratventricularmyocytes

【Abstract】AIM:TostudytheroleofcalciumoscillationsinreoxygenationinjuryinducedbyperfusionwithalowK+bufferinisolatedratventricularmyocytes.METHODS:Thecellswerefirstlysubjectedtometabolicinhibitionandanoxiafor25min,thenreperfusedwithnormal［K+］(5.4mmol/L)orlow［K+］(3.0mmol/L)TyrodesolutionintheabsenceorpresenceofKBR7943,aselectiveinhibitorofthereversemodeNa+/Ca2+exchanger(NCX).Thechangesof［Ca2+］iweremeasuredwithspectrofluorometry,usingFura2asCa2+indicator.Thechangesincelllengthweremonitoredandexpressedasarecoveryrateofcelllengththroughtheformula(endreperfusionlength-endischemialength)/(initiallength-endischemialength)×100%,reflectingthereperfusioninjury.RESULTS:Comparedwithnormal［K+］reperfusiongroup,reperfusionwiththelow［K+］Tyrodesolutionsuppressedtherecoveryofcelllength［P<0.01,low［K+］:(24.30±6.01)%vsnormal［K+］:(54.50±6.56)%,n=6］andincreasedthetotalnumberofCa2+oscillations［P<0.01,low［K+］:(138.80±9.54)vsnormal［K+］:82.30±8.16,n=6］.However,theseeffectsinducedbylowK+reperfusionweresignificantlyattenuatedinthepresenceof10μmol/LKBR7943［P<0.01vslow［K+］withoutKBR7943,n=6;Ca2+oscillations:27.40±6.76,recoveryofcelllength:(58.90±7.30)%,respectively］.CONCLUSION:Reperfusionwithlow［K+］bufferincreasesreversemodeNCXactivities,whichresultsinanincreasedcalciumoscillations,thusaggravatingcardiacinjury.

【Keywords】potassiumdeficiency;NCX;ventricularmyocyte;calcium/metabolism

【摘要】目的：观察低钾灌流液对大鼠心肌细胞再灌注时钙震荡的影响并探讨其作用机制.方法：Ca2+荧光指示剂Fura2标记心肌细胞，在代谢抑制并低氧25min后，改用低钾台氏液（［K+］=3.0mmol/L）灌流，记录细胞钙震荡的变化.以（再灌注末期细胞长度－缺血末期细胞长度）／（缺血前细胞长度－缺血末期细胞长度）×100%反映再灌注后细胞长度的恢复状况.结果：与含正常钾浓度的灌流液对照组（［K+］=5.4mmol/L）相比，在再灌注10min内，低钾灌流液组出现钙震荡的次数显著增加(P<0.01，低K+组：138.80±9.54vs对照组：82.30±8.16，n=6)，心肌细胞长度的恢复显著被抑制［P<0.01，低K+组：(24.30±6.01)%vs对照组：(54.50±6.56)%，n=6］；再灌注期间给予钠钙交换体反向交换模式抑制剂KBR7943，可显著抑制低钾溶液对钙震荡和细胞长度的影响［P<0.01vs低K+组，n=6；钙震荡：27.40±6.76和细胞长度恢复：(58.90±7.30)%］.结论：低钾再灌注液通过增强反向钠钙交换体活性加重钙震荡，进而引发心肌损伤.

【关键词】低钾；钠钙交换体；钙震荡；心肌细胞

细胞内钙（［Ca2+］i）超载是缺血心肌在再灌注过程中细胞凋亡、坏死、以及心功能降低的重要原因［1］.钠钙交换体（sodiumcalciumexchanger，NCX）是参与维持心肌钙稳态的重要转运体.研究发现，在缺血／再灌注早期激活NCX反向交换模式（Ca2+进入细胞），将促发心肌［Ca2+］i超载，导致心肌损伤［2-3］.目前，Zhang等［4］采用膜片钳技术观察到，［K+］o升高可抑制NCX反向交换电流，而［K+］o降低则起促进作用.如果再灌注早期［K+］o降低（［K+］o丢失），可能会通过促发NCX反向交换引起心肌［Ca2+］i超载，从而加重心肌损伤.本实验采用双激发荧光光电倍增系统检测细胞［Ca2+］i的方法，观察低钾灌流液对缺血后再灌注早期心肌［Ca2+］i震荡的影响，旨在探讨其可能的机制.

1材料和方法

1.1材料正常SD雄性大鼠（200~250g）15只由第四军医大学实验动物中心提供.KBR7943英国Tocris公司；HEPES，I型胶原酶，BSA，谷氨酸钾，K2EGTA，Taurine，Fura2/AM和脱氧葡萄糖（Deoxyglucose）均为美国Sigma公司产品，其余试剂均为国产分析纯；双激发荧光光电倍增系统为美国IonOptix公司产品.正常K+浓度台氏液（mmol/L，Standard）：NaCl140，KCl4.2，MgCl21.0，KH2PO41.2，CaCl21.8，HEPES10，葡萄糖10，用NaOH调pH至7.4；低浓度K+台氏液（mmol/L，LowK+）：KCl1.8，KH2PO41.2，其余成分与正常K+浓度台氏液相同.KB液（mmol/L）：Kglutamate120，KCl10，KH2PO410，MgSO41.8，K2EGTA0.5，牛磺酸10，HEPES10，glucose20，用KOH调pH至7.2.模拟缺血溶液：正常台氏液中去除glucose，并添加10mmol/L脱氧葡萄糖，并持续充以纯N2，pH=6.4.

1.2方法

1.2.1心肌细胞分离按文献［5］的方法制备心室肌单细胞.步骤：SD雄性大鼠断头处死，迅速摘取心脏并固定于Langendorff灌流系统，在37℃和通氧条件下依次用下述溶液灌流.①含1.8mmol/LCa2+台氏溶液5min；②无Ca2+台氏溶液15~20min；③含0.5g/LI型胶原酶以及1g/LBSA的无Ca2+台氏溶液30~40min.灌流结束后，取左心室心肌组织，将其置于KB溶液中剪碎、吹打并过滤，获得单个心肌细胞，KB液中保存1h后，将心肌细胞置于含10g/LBSA1.8mmol/LCa2+台氏溶液中备用.

1.2.2Fura2/AM负载［6］将心肌细胞混悬液置于离心管内，加入Fura2/AM（终浓度为1μmol/L），于室温负载30min，不断振摇，然后用含10g/LBSA1.8mmol/LCa2+台氏液洗涤数次，洗去胞外残留的Fura2/AM，静置30min备用.

1.2.3细胞长度和心肌细胞［Ca2+］i测定［5］取负载好Fura2/AM的细胞悬液加于0.5mL灌流槽中，待细胞贴壁后，于倒置显微镜下选择边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无自发性收缩的心肌细胞，在室温下进行实验.溶液灌流速度保持在1mL/min.通过摄像系统观察细胞长度的变化并储存于计算机，以便后续分析.我们以（再灌注末期细胞长度－缺血末期细胞长度）／（缺血前细胞长度－缺血末期细胞长度）×100%反映再灌注后心肌细胞长度恢复率.Ca2+荧光信号的检测采用双激发荧光光电倍增系统.75W紫外氙光灯发射的光通过340nm或380nm的滤光片到达心肌细胞，细胞内与游离Ca2+结合的荧光物质被激发，其发射光在510nm处被检测并通过光电倍增管记录.细胞相继迅速被340nm和380nm激发光照射并交替扫描，细胞内游离Ca2+浓度的改变由上述两种波长荧光强度的比率所反映.

1.2.4缺血后再灌注处理用模拟缺血液持续灌流25min，然后进行不同处理15min.对照组：正常浓度K+（5.4mmol/L）的台氏液灌流；低K+灌流液组(低K+组)：低K+（3.0mmol/L）的台氏液灌流；KBR+低K+组：含10μmol/LKBR7943的低K+（3.0mmol/L）台氏液灌流.每组分别观察6个细胞.在整个实验过程中，进行连续心肌细胞［Ca2+］i测定，观察细胞［Ca2+］i的变化.

统计学处理：实验数据以x±s的形式表示.用SPSS11.0统计软件进行分析，统计分析采用方差分析，多重比较采用LSDt检验，检验标准以P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1低K+台氏液再灌注后心肌细胞钙震荡的变化以及反向NCX抑制剂的影响细胞在经受25min代谢抑制和无氧后，分别用含正常K+浓度的对照组及低K+台氏液灌流15min，在此期间记录到的心肌细胞［Ca2+］i的变化图.对照组的钙震荡的总数为82.3±8.16，而低K+台氏液灌流时出现钙震荡的总数显著增加，为138.8±9.54（P<0.01）.再灌注期加入10μmol/LKBR7943后，低K+台氏液引起的钙震荡数目显著减少，为27.4±6.76（P<0.01，图1）.

2.2低K+台氏液再灌注后心肌细胞长度恢复的变化以及反向NCX抑制剂的影响代谢抑制和无氧处理末期，杆状心肌细胞长度较缺血前缩短(40±3)%.在低K+台氏液再灌注后，细胞长度的恢复显著低于对照组，两组的长度恢复分别为(54.50±6.56)%和(24.30±6.01)%（P<0.01，n=6，图2）.再灌注时加入10μmol/L反向NCX抑制剂KBR7943后，低K+台氏液对细胞长度的影响显著减弱，细胞长度恢复（58.9±7.3）%（P<0.01vs低K+组；n=6，图2）.

3讨论

本实验首次观察到：①缺血后应用低K+液灌流，细胞发生钙震荡的频率显著增加，与细胞长度恢复呈反相关系；②加入反向NCX抑制剂后，低K+灌流液对细胞钙震荡和细胞长度的影响明显受到抑制.上述结果表明，缺血后低K+灌流液通过激活反向NCX活性，加剧［Ca2+］i超载，从而加重心肌损伤.

实验显示，改变灌流液中钾离子浓度将影响细胞钙震荡的频率.由于NCX是参与钙震荡形成的重要分子，上述结果提示细胞外钾离子浓度（［K+］o）可能通过调节NCX的交换活性影响钙震荡的形成.实验中我们应用反向NCX抑制剂KBR7943，发现低［K+］o对钙震荡的增强作用明显减弱，表明改变［K+］o能影响NCX的活性.这与Zhang等［4］人的研究结果相吻合.目前认为，再灌注早期钙震荡的形成是由于此时舒张期［Ca2+］i明显升高，大量Ca2+在胞质和肌浆网之间循环造成的.已经证实，通过抑制NCX反向交换模式减少Ca2+进入细胞将减少产生钙震荡的发生，从而保护心肌细胞［2］.本实验发现，低［K+］o显著增加大鼠左心室肌细胞钙震荡的频率，抑制心肌细胞长度的恢复，加重心肌的损伤，而NCX反向交换模式抑制剂KBR7943可以明显减弱［K+］o的损伤作用，说明［K+］o的损伤作用与增强NCX反向交换活性有关.

然而［K+］o的这种作用是通过何种机制目前仍不清楚.已知NCX交换方向取决于膜两侧Na+和Ca2+电化学梯度以及细胞膜电位［7-9］.改变［K+］o将有可能通过影响上述因素而间接影响NCX的交换模式.因此低K+再灌液是直接还是间接调控NCX还有待进一步研究.

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